树突状细胞核蛋白1的核定位信号鉴定

陶瑞松，徐忠东，王 伟

（合肥师范学院 生命科学系，安徽 合肥230601）

重性抑郁障碍(major depressive disorder，MDD）,又称重性抑郁症，是一种常见的严重的精神类疾病，其发病机制尚未明确。根据世界卫生组织的统计，重性抑郁障碍发病呈逐年上升的趋势，如浙江省的MDD 患病率已达4.3%。[1]该疾病的典型症状为长期心境抑郁，对曾经感到有趣的活动丧失兴趣，对患者的正常生活造成严重影响。[2]在美国型患者自杀几率约为3.4%，而且近60%的人患有其他心境障碍。因而重性抑郁障碍是一种致残性的疾病，严重影响人们的身体、精神和活动，给家庭和社会造成沉重的负担。

树突状细胞核蛋白1（DCNP1），由244 个氨基酸组成，分子量为27kD,定位于人染色体5q31 区的外显子，主要在脑和骨骼肌中表达；在成熟的树突细胞内定位于细胞核的核周。[3，4]由于DCNP1 分子量较小，理论上应该可以自由出入细胞核，因而我们认为DCNP1 分子上应该存在定位于核内的核定位信号序列。近年研究发现DCNP1 蛋白的117 位氨基酸表达的提前终止所形成的突变体会增加MDD 发病的危险，因而认为DCNP1 是MDD 发病的一个潜在候选基因。[5]本研究通过对DCNP1 序列的分析和实验的方法鉴定DCNP1 的核定位信号序列。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表达载体pEGFP-N1 购自Clontech,Mutanbest突变试剂盒为TAKARA 公司产品;Lipofectamine2000、DMEM、胎牛血清购自Invitrogen;倒置荧光显微镜观察亚细胞定位在本校实验室进行。

1.2 载体的构建

野生型DCNP1 的绿色荧光融合蛋白的构建:以人胚胎肾293 细胞全细胞RNA 抽提物为模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’，采用RT-PCR 扩增DCNP1 编码序列，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到绿色荧光蛋白pEGFP-N1 构建成pEGFP-N1-DCNP1。

DCNP1 氨基端突变体（DCNP11-116）的绿色荧光融合蛋白构建：以DCNP1 为模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’，和下游引 物5’ -CTGGATCCTTGCTGCTATGCAGTTC -3’,采用PCR 扩增得到重组的突变体DCNP11-116。经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到绿色荧光蛋白pEGFP-N1 构建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 羧基端突变体（DCNP1117-244）的绿色荧光融合蛋白构建：DCNP1 为模板,使用上游引物5’-GAGTCGACGATGAGAAGGAAGACAGGC-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’, 采 用PCR 扩增得到重组的突变体DCNP1117-244。经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到绿色荧光蛋白pEGFPN1 构建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 删除第117-119 位氨基酸残基的突变体的绿色荧光融合蛋白的构建：根据TAKARA 公司突变试剂盒说明，以pEGFP-N1-DCNP1 为模板，使用上游引物5’-GCTGCTATGCAGTTCATCCTG-3'和下游引物5’-ACAGGCCAGACCAGGCGGGAG-3' 采用PCR 扩增得到重组的突变体pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。

所有构建的重组质粒都经过上海生工测序验证，野生型及突变型DCNP1 与GFP 融合蛋白的重组结构示意图，如图1。

图1 野生型及突变型DCNP1 与GFP融合蛋白的重组结构示意图

1.3 质粒转染及细胞内荧光表达

用含有10%胎牛血清的DMEM （Invitrogen）培养293FT 细胞过夜，将细胞用Opti-MEM 清洗后转染质粒。使用Lipofectamine2000 转染试剂盒在无血清的DMEM 中转染各种质粒。转染6h 后换含有10%的胎牛血清的DMEM 的完全培养基。转染36小时后通过倒置荧光显微镜放大40 倍进行观察。

2 结 果

为了观察野生型DCNP1 以及各种突变型DCNP1 的亚细胞定位特性，我们构建了pEGFPN1-DCNP1，pEGFP-N1-DCNP11-116，pEGFP-N1-DCNP1117-244和pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。然后将这些质粒在293FT 细胞中分别进行转染。转染36h 以后，带有荧光蛋白标记的细胞通过倒置荧光显微镜进行观察。结果显示野生型DCNP1 如预期一样定位于细胞核的核周，然而DCNP11-116丧失了核定位的特性，随机分布于细胞质和细胞核中；DCNP1117-244还分布与核内；而缺失了第117-119 位氨基酸残基的DCNP1 突变体同样丧失了原有的核定位的特性，只分布于细胞质中，如图2。

图2 野生型及突变型DCNP1 与绿色荧光蛋白（GFP）重组后的亚细胞定位

3 讨 论

细胞核的核孔复合体能够允许水溶性小分子物质进入或输出核膜，运输的物质包括出核的RNA、核糖体以及进核的蛋白质、碳水化合物和信号分子等物质。[6]显而易见小分子物质可以通过扩散作用通过核孔复合体，而大分子物质可能要被特异的信号序列识别后在核孔蛋白的帮助下出入细胞核。[7,8]核定位信号序列正是这样一类氨基酸序列，它将蛋白质标记后通过转运进入核内。因而任何一种带有核定位信号的蛋白均可以有效地通过核孔复合体进入核内。[9]

DCNP1 蛋白由244 个氨基酸组成，主要分布与核周。在293FT 细胞中DCNP1117-244的分布与DCNP1 基本一致，分布于核内。然而第117-119 位氨基酸残基缺失的DCNP1 突变体却丧失了原有的核定位的功能，只存在于细胞质中。甚至DCNP11-116由于117 位之后的氨基酸的缺失导致其在细胞质和细胞核内都有分布。对照DCNP1 蛋白的氨基酸组成发现第117-119 位氨基酸分别是赖氨酸、赖氨酸和精氨酸，而核定位信号通常由一段富含赖氨酸、精氨酸等氨基酸的短肽组成，具有高度通透性，介导蛋白质进入核内。[10]因此我们认为第117-119位氨基酸序列是DCNP1 蛋白的核定位信号序列，其117 位氨基酸翻译的终止改变了其亚细胞定位。并且117 位氨基酸翻译的提前终止增加了MDD 发病的风险，所以我们推测DCNP1 细胞定位的改变可能在MDD 发病中有一定的关联作用。

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