RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

陈艳媛，廖慧娟，张 灵，郭亦然，朱优鹏，方 芳

(吉林医药学院,吉林 吉林 132013)

·论 著·

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

陈艳媛，廖慧娟，张 灵，郭亦然，朱优鹏，方 芳*

(吉林医药学院,吉林 吉林 132013)

目的为研究CD147分子在前列腺癌PC-3细胞中的生物学功能，通过RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达CD147分子的前列腺癌PC-3细胞株。方法利用脂质体2000将靶向CD147干扰质粒导入前列腺癌细胞中，干扰前列腺癌细胞中CD147分子的表达；有限稀释法获取单个细胞克隆，通过G418筛选出抗性克隆并利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot免疫印迹法分别从转录水平和蛋白水平进行鉴定。结果与转染pSilencer-Scramble对照质粒比较，转染pSilencer-CD147干扰质粒明显抑制CD147基因和蛋白表达水平(P<0.05)。结论靶向CD147的干涉载体能有效沉默PC-3细胞中CD147基因和蛋白的表达，通过G418筛选建立出稳定细胞株，为进一步研究CD147的功能打下基础。

RNA干扰；CD147；前列腺癌

前列腺癌(prostate cancer,PCa)已经成为美国男性最为常见的恶性肿瘤，在男性因肿瘤引起死亡的疾病中，占据第二位。在国内，前列腺癌的发病率也呈逐年升高的趋势[1]。CD147是一种跨膜糖蛋白，在多种肿瘤中表达增高，其表达水平和肿瘤的侵袭及转移等密切相关。研究证实，与前列腺增生、正常和胚胎性前列腺组织相比，CD147在前列腺癌中异常高表达[2]；CD147的表达水平与PCa的TNM分期、Gleason评分呈正相关，与癌细胞分化程度呈负相关[3]。本研究利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术和细胞转染技术将靶向CD147表达的RNAi质粒导入前列腺癌PC-3细胞中，通过G418抗性筛选，建立稳定低表达CD147的前列腺癌PC-3细胞，为进一步指导后续实验研究CD147的功能打下基础。

1 对象与方法

1.1材 料

pSilencer-CD147干扰质粒由吉林医药学院王立国博士赠送；前列腺癌PC-3细胞购自ATCC。

进口胎牛血清购自Gibco公司；RPMI1640购自SIGMA-ALDRICH公司；LipofectamineTM2000和G418购自美国Invitrogen公司；兔抗CD147和β-actin抗体购自GeneTex公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Bradford法蛋白测定试剂盒均购自江苏海门市碧云天生物技术研究所；总RNA/mRNA提取试剂盒和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒购自北京鼎国公司。

1.2G418筛选浓度的选择

将培养好的PC-3细胞接种到96孔板中，接种量以第2天长成25%单层为宜，37 ℃培养过夜。次日将培养液换成含G418培养液，G418浓度分别为0、50、100、200、400、600、800、1 000和1200 μg/mL。每2～3 d换液1次，观察细胞在10～12 d全部死亡的G418浓度为G418压力筛选浓度，正式筛选浓度高于该浓度一个级别。实验结果表明800 μg/mL培养12 d细胞全部死亡，因此筛选浓度为1 000 μg/mL。

1.3细胞转染和稳定细胞建立

转染前1天将细胞接种于24孔板中，第2天细胞长到80%左右进行转染。根据LipofectamineTM2000操作手册将pSilencer-Scramble质粒(阴性对照)和pSilencer-CD147干扰质粒分别转染到PC-3细胞中。转染48 h后加入1 000 μg/mL G418培养2 d，将存活下的细胞进行有限稀释，稀释细胞浓度为1/100 μL，按照每个孔100 μL加入到96孔板中，镜下检测单孔单个细胞并标记，加终浓度1 000 μg/mL的G418继续培养。挑取在G418压力筛选下存活的克隆，消化细胞并转移细胞至24孔板中、继续以G418培养，继续将细胞扩增至12孔板、6孔板和培养瓶中，获得单克隆细胞，并将转染pSilencer-Scramble质粒的稳定株命名为PC-3/Scramble细胞，将转染pSilencer-CD147质粒的稳定株命名为PC-3/shCD147细胞。

1.4RT-PCR检测CD147基因表达

用总RNA/mRNA提取试剂盒提取总RNA，取细胞总RNA 1 μg，以Oligo(dT)为引物反转录为cDNA，采用RT-PCR方法检测CD147在mRNA水平上的表达，并且以β-actin作为内参。CD147引物为：CD147-forward 5′-aaggtggactccgacgaccagtgg-3′，CD147-reverse 5′-cttccggcgcttctcgtagatgaag-3′；β-actin引物为：β-actin-forward 5′-atcatgtttgagaccttcaaca-3′，β-actin-reverse 5′-catctcttgctcgaagtcca-3′。实验应用25 μL反应体系。设置反应条件94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s进行30个循环扩增反应后72 ℃ 10 min延伸。对扩增基因在1.2%胶浓度并含EB的琼脂糖上进行电泳。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

1.5Western blot检测CD147蛋白水平的表达

取30 g蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶上蛋白移至PVDF膜，于50 g/L脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，加兔抗CD147(1∶1 000)，小鼠抗β-actin抗体(1∶3 000)，4 ℃过夜。TBST洗膜，分别加HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶3 000)室温避光孵育2 h。TBST洗膜后，加底物ECL发光显影。使用Quantity One软件扫描并做灰度分析。

1.6统计分析

2 结 果

2.1RT-PCR结果

RT-PCR结果表明，与阴性对照PC-3(1.75±0.21)和pSilencer-Scramble(1.67±0.18)细胞比较，转染pSilencer-CD147干扰质粒组PC-3细胞中CD147 mRNA表达水平显著下降(0.79±0.11)(P<0.05)(图1)。

2.2Western Blot结果

与阴性对照PC-3(1.64±0.25)和pSilencer-Scramble(1.42±0.14)细胞比较，转染pSilencer-CD147干扰质粒组PC-3细胞中CD147蛋白表达水平显著下降(0.58±0.08)(P<0.05)(图2)，这同RT-PCR检测结果相互对应。

图 1 RT-PCR鉴定稳定细胞株中CD147基因表达

图 2 Western blot鉴定稳定细胞株中CD147蛋白表达

3 讨 论

RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA(dsRNA)特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链的dsRNA，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的[4-5]。RNAi技术是基因功能和治疗中的一种全新的研究手段。与传统的基因研究和治疗方式如反义寡核苷酸治疗等相比，RNAi具有高特异性，识别可以精确到一个核苷酸[6-7]；以催化放大的方式抑制基因，比反义基因特异性和效率性高10倍以上[8]；具有高稳定性、细胞摄取相对容易、毒性小等优点。

本研究利用RNAi技术和细胞转染技术将外源基因导入前列腺癌PC-3细胞中，观察CD147在前列腺癌PC-3细胞的表达情况。常规含10%FBS的RPMI 1640培养液培养细胞，传代后用pSilencer-Scramble质粒(阴性对照)和pSilencer-CD147干扰质粒分别转染PC-3细胞,先利用G418筛选出部分阳性细胞，再采用有限稀释法挑选单个细胞克隆。经过长期传代培养，RT-PCR、Western Blot检测CD147在mRNA和蛋白水平变化。实验结果表明，与PC-3细胞相比较，转染pSilencer-Scramble质粒后，CD147的表达水平无明显变化；转染pSilencer-CD147干扰质粒实验组可观察到CD147在mRNA和蛋白水平的表达显著降低，证明在G418抗性筛选下建立了稳定低表达CD147的PC-3细胞系。

综上所述，运用RNAi技术和细胞转染技术，将外源基因导入前列腺癌PC-3细胞，我们成功筛选出CD147 RNAi稳定前列腺癌PC-3细胞株。为进一步指导后续实验研究CD147的功能打下基础，为临床上前列腺癌的治疗提供新的思路。

[1] Greenlee R T,Murray T,Bolden S,et al.Cancer statistics 2000[J].CA Cancer J Clin,2000,50(1):7-33.

[2] Zhong Weide,Liang Yuxiang,Lin S X,et al.Expression of CD147 is associated with prostate cancer progression[J].Int J Cancer，2012，130(2):300-308.

[3] 邹 钧，张 征,张 阳,等.CD147在前列腺癌组织中的表达及意义[J].中华泌尿外科杂志，2007，28(11)：763-765.

[4] Nykänen A,Haley B,Zamore P D.ATP requirements and small interferings RNA structure in the RNA interference pathway[J].Cell,2001,107(3):309-321.

[5] Matzke M,Matzke A J,Kooter J M.RNA:guiding gene silencing[J].Science,2001,293(5532):1080-1083.

[6] Bass B L.RNA interference.The short answer[J].Nature,2001,411(6836):428-429.

[7] Kawasaki H,Taira K.Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells[J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):700-707.

[8] Nagy P,Arndt-Jovin D J,Jovin T M.Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP-fused epidermal growth factor receptor(erbB1) and induce apoptosis in erbB1-overexpressing cells[J].Exp Cell Res,2003,285(1):39-49.

EstablishmentofCD147expressstableprostatecancerlinePC-3byRNAinterference

CHEN Yan-yuan,LIAO Hui-juan,ZHANG Lin,GUO Yi-ran,ZHU You-peng,FANG Fang*

(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013，China)

ObjectiveTo study the biological behavior of CD147 in prostate cancer cellline PC-3,and establish the lower expression of CD147 stable prostate cancer line PC-3 by RNA interferenc.MethodsTargeting CD147 interference plasmid was transfected into prostate cancer PC-3 cell by the method of lipofectamine 2000.The single cell clones from limiting dilution were screened by G418 and the mRNA and protein expression were examined by RT-PCR and Western blot.ResultsCompared with cells transfected pSilencer-Scramble,cells transfected pSilencer-CD147 expression vector were inhibited both mRNA and protein expression of CD147(P<0.05).ConclusionSequence-specific RNAi vector targeting CD147 is capable of suppression CD147 gene and protein expression in prostate cancer PC-3 cell,which is the foundation for researching CD147 function.

RNA interference;CD147;prostate carcinoma

R737.25

A

2013-08-24)

1673-2995(2013)06-0404-03

吉林医药学院大学生科研基金资助项目(201213).

陈艳媛(1989-)，女(汉族)，在读本科.

方 芳(1973-)，女(汉族)，副教授，博士.