顺铂诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡与自噬的研究

金镇勋,兰汝春,王 菲,董长松，徐 冶

(吉林医药学院:1.附属医院消化科,2.医学科研实验室，吉林 吉林 132013)

·论 著·

顺铂诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡与自噬的研究

金镇勋1,兰汝春1,王 菲1,董长松1，徐 冶2*

(吉林医药学院:1.附属医院消化科,2.医学科研实验室，吉林 吉林 132013)

目的探讨顺铂对Hela细胞凋亡和自噬的影响。方法用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)观察顺铂对HeLa细胞生长抑制情况； Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡；间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和P62的变化；免疫印记法检测细胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3和自噬标志蛋白LC3和P62的变化。结果顺铂对Hela细胞生长抑制作用表现为时间剂量依赖关系；顺铂作用Hela细胞导致Bax/Bcl-2比值和Caspase-3表达增加，同时自噬标志蛋白LC3和P62活化。结论顺铂诱导Hela细胞发生凋亡，伴有自噬发生。

顺铂;宫颈癌;凋亡;自噬

顺铂(cisplatin，DDP) 以及它的同类物被临床广泛用于治疗多种恶性肿瘤，虽然具有一定的肾毒性和耳毒性，但还是取得了令人满意的效果[1]。宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，顺铂作为首选化疗药物之一,其宫颈癌疗效是肯定的；然而，目前对其作用机制还不十分清楚[2]。本研究以人宫颈癌HeLa细胞系为研究对象，观察顺铂对HeLa细胞的生长抑制作用，对细胞凋亡和自噬的影响，探讨顺铂抗宫颈癌的作用机制，以期为临床应用提供新的实验数据。

1 材料与方法

1.1材 料

顺铂为山东齐鲁制药有限公司产品(批号:705021CF)，用生理盐水配制成1 000 μg/mL的储存液，过滤除菌，4 ℃保存，用时以IMDM培养基(Gibco公司)稀释至所需浓度；p62鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司、LC3兔多克隆抗体购自美国Epotomics公司；Hoechst 33342荧光染料购于北京鼎国公司；四甲基偶氮唑蓝[3-(4，5-dimethy-2-thiazoly)-2，5-diphenyl-2-tet-razoliumbromide，MTT]购于美国Sigma公司。

1.2细胞培养

人宫颈癌Hela细胞株由吉林大学白求恩医学院病理生理学系惠赠，用含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的IMDM培养基，青霉素和链霉素浓度均为100 U/mL，37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT法检测

取对数生长期细胞以5×104/mL密度接种于96孔板，培养24 h。实验组按DDP终浓度分为:1.5、3、4.5、6、12、18 μg/mL组；同时设单加培养液空白对照组和不加药物作用阴性对照组，每组设3个复孔。药物作用24 h或48 h时每孔加入MTT 20 μL，作用4 h，吸去培养液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，Model 680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)490nm波长测定光密度(OD)值。测3次，取平均值。细胞生长抑制率=1-(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值- 空白组OD值)×100%。

1.4免疫印记法检测细胞凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3和自噬标志蛋白LC3和p62

实验组(DDP 6 μg/mL处理6、12、24 h)及未加DDP的阴性对照组细胞消化收集于离心管中，加入细胞裂解液冰上静置15 min，10 000 g离心15 min收集上清，Bradford法测蛋白浓度，-20 ℃备用。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶常规电泳、转膜，封闭、一抗4 ℃过夜，二抗2 h，DAB显色，上海天能2500R凝胶成像仪照相分析。

1.5Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡

高压消毒后无菌盖玻片置于24孔板中，取细胞密度1×105/mL，每孔500 μL接种过夜，次日细胞长至80%密度，实验组加DDP 6 μg/mL处理24 h，同时设置未加DDP的阴性对照。弃去培养基，加入200 μL固定液(4%多聚甲醛)作用10 min，吸去固定液加0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤后，吸尽液体加200 μL Hoechst 33342染色液染色5 min，再用0.01 mol/L PBS溶液洗涤，抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察取图。

1.6间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和p62

细胞爬片及给药方法同上。爬片固定后经0.1%TritonPBS作用5 min，0.01mol/L PBS溶液洗涤，非免疫山羊血清封闭30 min，加入预混的一抗4 ℃过夜，0.01mol/L PBS溶液洗涤，加入预混的荧光二抗作用30 min，0.01mol/L PBS溶液洗涤，抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察。

1.7统计学方法

2 结 果

2.1DDP对Hela细胞的生长抑制作用

顺铂对HeLa细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性，药物处理时间越长，药物浓度越高，顺铂对HeLa细胞的生长抑制率有明显的增加趋势(图1)。

图 1 MTT法检测DDP对Hela细胞生长抑制率

2.2DDP诱导Hela细胞凋亡蛋白、自噬蛋白表达

免疫印记法检测细胞凋亡蛋白和自噬标志蛋白的表达，可见随着作用时间的延长，实验组表现为Bax/Bcl-2比值增高和Caspase-3蛋白表达明显增加；LC3II/LC3I比值增高而p62蛋白表达明显下降(图2)。

图 2 Western Blot检测凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3，自噬蛋白LC3、p62表达变化(*P<0.05 VS Control)

2.3DDP诱导Hela细胞凋亡、自噬的形态学改变

Hoechst 33342荧光染色显示，活细胞所发荧光较弱且均匀，而经DDP 6 μg/mL作用24 h后，部分Hela细胞核明显变小，可见致密强荧光，有的呈颗粒状或碎块状，为典型的细胞凋亡形态(图3A)。

间接免疫荧光法检测自噬标志蛋白LC3和p62，对照组可见LC3和p62蛋白均呈散在分布，荧光较弱；实验组LC3和p62蛋白均呈聚集状，有明显的共定位，荧光较强(图3B)。

图 3 激光共聚焦检测细胞凋亡、自噬(Bar=10μm)

3 讨 论

顺铂是宫颈癌最常用的化疗药物之一，其杀伤肿瘤细胞的作用机制主要是能与DNA或蛋白质形成交联物，影响DNA的复制和修复，干扰了细胞的有丝分裂，抑制细胞增殖[3]。本研究中发现顺铂对Hela细胞的生长抑制作用呈现时间和剂量依赖效应，随着药物浓度和作用时间的增加，细胞生长抑制率也明显增加。在临床应用中，顺铂的肾毒性和耳毒性以及原发和继发性的耐药限制了它的使用[4]。

目前为止，虽然已经开展并获得了一部分实验证据，但是顺铂对肿瘤细胞的作用机制和肿瘤对其耐药机制仍不清楚。本研究通过共聚焦显微镜观察到顺铂作用后Hela细胞核形态发生明显的凋亡，同时，免疫荧光结果显示自噬标志蛋白LC3和p62均被活化，呈现聚集状态，且有明显的细胞内共定位。这提示顺铂诱导Hela细胞发生凋亡的同时伴有自噬的发生。进一步的免疫印记结果显示，凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值增高和Caspase-3蛋白表达明显增加；自噬标志蛋白LC3II/LC3I比值增高而p62蛋白表达明显下降。这表明顺铂作用于Hela细胞触发了Bcl-2家族介导的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，而促凋亡蛋白Bax表达增加，Bax/Bcl-2的比值增高，通过Caspase家族的级联反应，最终活化了Caspase-3导致了细胞凋亡[5]。

LC3蛋白是细胞自噬的标志蛋白，其在自噬时由LC3I转化为活化的LC3II，同时，结合p62蛋白并聚集于自噬体膜上，随着自噬的进展，p62蛋白也被溶酶体酶所降解，本研究结果与此一致[6]。表明顺铂作用于Hela细胞诱导了自噬的发生。

顺铂诱导肿瘤细胞发生自噬的机制及其与凋亡的关系都还没有明确，已有研究结果显示顺铂诱导的内质网应激可能是调控这两者的上游信号；也有研究表明，化疗引发的自噬可能参与了肿瘤的耐药[7-10]。因此，进一步深入研究顺铂对肿瘤细胞的作用机制，明确其诱导的自噬和凋亡的相互作用关系，以及自噬在肿瘤耐药中的作用等，必将为临床化疗方案的选择和药物的开发提供新的线索。

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CisplatininducedapoptosisandautophagyonhumancervicalcarcinomaHeLacells

JIN Zhen-xun1,LAN Ru-chun1,WANG Fei1,DONG Chang-song1,XU Ye2*

(1.Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital,2.Medical Research Laboratory,Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

ObjectiveTo investigate the apoptosis and autophagy inducing effect of Cisplatin on HeLa cells.MethodsMTT assay was employed to examine the growth suppression of the cells.Hoechst33342 staining was used to observe the apoptosis.Indirect immunofluorescence was used to detect the expressions and location of the LC3 and P62 proteins.Western Blotting was used to detect the expressions of Bax/Bcl-2,Caspase-3,LC3 and P62.ResultsThe inhibitory effect of Cisplatin was in a time and dosage dependant manner. Cisplatin could increase the ratio of Bax/Bcl-2 and expression of caspase-3.Cispaltin treatment induced activation of LC3 and P62.ConclusionCisplatin could induce apoptosis of HeLa cells paralleled autophagy.

Cisplatin;cervical cancer;apoptosis;autophagy

R737.33

A

2013-08-19)

1673-2995(2013)06-0401-04

吉林省科技厅资助项目(201015240),吉林省教育厅资助项目(2013361).

金镇勋(1973-)，男(朝鲜族)，主治医师，本科.

徐 冶(1972-)，男(汉族)，教授，博士.