建立基于RNA免疫共沉淀技术的鼠疫耶尔森菌Hfq蛋白相关sRNA的体内验证方法

孟祥荣 ，苏山春 ，邓仲良 ，刘子中 ，杨瑞馥 ，韩延平 ，黄新祥

1.江苏大学 基础医学与医学技术学院，江苏 镇江 212000；2.军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；3.四川农业大学 动物医学院，四川 雅安 625014

鼠疫耶尔森菌（以下简称鼠疫菌）能引起严重危害人类健康的烈性传染病——鼠疫。鼠疫菌的天然宿主是啮齿动物，传播媒介主要是跳蚤，在合适的环境下，鼠疫菌可在自然界长期存活，使所在地区成为鼠疫自然疫源地，近年来鼠疫又有重新抬头的趋势。

细菌非编码小RNA（small non-coding RNA，sRNA）是近年来生命科学领域的研究热点。sRNA通常位于基因间区（intergenic regions，IGR），长度为50～500 bp，有特殊的茎环结构。这些非编码RNA不翻译成蛋白质，以RNA的形式在细菌保持基因组稳定性、生长代谢和致病机制等很多方面发挥着调控作用，例如可通过碱基反向互补调控靶mRNA翻译和稳定性。在大肠杆菌中，已证明sRNA分子参与了包括翻译调控、铁代谢、膜蛋白生物合成、糖代谢、群体感应及致病菌的致病力调节等诸多生命过程[1-2]。sRNA调控基因表达主要有2种方式，一种为反式编码的反义sRNA通过碱基结合方式结合到靶mRNA上，影响后者的翻译和稳定性[3]；另一种结合方式是分子模拟，sRNA提供RNA结合蛋白如CsrA/RsmA家族的结合位点，从而调节蛋白活性[4]。

Hfq（host factor for RNA phage Qβ replicase）在细菌体内广泛存在，作为大多数sRNA的伴侣分子，是一种转录后水平的整体调控子。Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，被认为是细菌基因转录后调控的关键因子。Hfq包含2个结构域Sm1和Sm2，两者共同形成一个同源六聚体的拓扑结构[5]。研究发现，Hfq与包括鼠疫菌在内的多种病原菌的毒力相关，许多sRNA可能参与其中。Hfq作为一种RNA分子伴侣，能与大量sRNA和mRNA结合，影响sRNA的稳定性和sRNA-mRNA的配对[6-9]。

RNA-蛋白免疫共沉淀技术（RNA-binding pro⁃tein immunoprecipitation，RIP）是一种新兴技术，类似于染色质免疫沉淀技术（CHIP），但它是利用蛋白-RNA之间的相互作用，而不是蛋白-DNA的作用。Hfq作为一种有效的RNA结合蛋白，与细菌的众多RNA相互作用，为我们的研究奠定了基础。利用RIP技术可有效地得到Hfq在体内结合的RNA，通过Northern印迹检测可初步验证，并通过后期的RIP-seq、RT-PCR和RIP-chip的分析，可以直接对Hfq结合的RNA进行定性定量分析。因此，我们以鼠疫菌的RyhB1和RyhB2为研究对象，拟建立一种RNA-蛋白免疫共沉淀技术，鉴定与细菌Hfq结合的sRNA，为细菌sRNA验证和功能解析等提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠疫菌野生株201株为田鼠型菌株，基于λRed同源重组系统构建鼠疫菌Hfq敲除株，在Hfq敲除基础上导入pACYC184-hfq-Flag质粒，构建带有标签的实验菌株；在野生株基础上导入pACYC184-Flag，构建带有标签的对照菌株；均由本室保存。

TMH培养基：人工配制含盐、维生素、稳定及不稳定氨基酸等多种营养成分的限制性培养基，使铁终浓度为10 μmol/L，用5.5 mol/L NaOH调节pH值为7.2，过滤除菌，4℃保存。

dNTP、RNase和GoldView染料购自北京欣经科生物有限公司；Taq DNA聚合酶、DNA marker DL2000购自TaKaRa公司；Magna RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit购自Milllipore公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；ULTRAhyb杂交液购自Ambion公司；Nylon Membrances，positively charged、DIG Wash and Block Buffer Set、Anti digoxigenin-AP conjugate、CDP-Star、Hybridization Bags等购自Roche公司。引物和探针见表1。

1.2 载体构建及PCR验证

设计并构建重组载体，加入3×Flag标签，本实验使用pACYC184载体，重组质粒导入Δhfq（已敲除成功，由本实验室保管）和野生株中。分别构建带标签的Hfq互补株实验株和带标签的对照株。通过PCR鉴定和基因测序证实构建成功。

1.3 生长曲线绘制

将鼠疫菌野生株201株（WT）、鼠疫菌Hfq敲除株、在Hfq敲除基础上导入pACYC184-hfq-Flag质粒构建的实验菌株和在WT基础上导入pA⁃CYC184-Flag质粒构建的对照菌株等4株实验用菌株分别接种于含相应抗生素的LB和TMH培养基中，26℃培养至对数后期，1/40稀释至新鲜LB和TMH培养基中，26℃培养至对数中期（D620nm=1.0～1.2），1/40稀释至含新鲜LB和TMH培养基的50 mL三角瓶中，26℃培养，每隔2 h测其D620nm值，连续监测46 h并绘制生长曲线，每株菌重复3次。

1.4 RNA-蛋白免疫共沉淀技术

1.4.1 细胞裂解液上清制备 4℃、12 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀物，弃上清液，用预先冰浴冷却的PBS重悬细胞，4℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清，洗涤2次；加入适量RIP洗涤缓冲液、蛋白酶抑制剂混合液、RNase抑制剂，充分混匀，避免产生气泡；超声波裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心10 min，上清液将用于免疫沉淀，-80℃贮存。

表1 引物和探针序列

1.4.2 磁珠的准备 在清洗过程中，吸管头须无RNase污染。完全分散重悬磁珠，每管加50 μL磁珠悬液，再加0.5 mL RIP洗涤缓冲液，涡旋洗涤后将管置于磁力分离器上，当磁珠聚集后弃上清，共2次洗涤；每管加100 μL RIP洗涤缓冲液，重悬磁珠后加5 μg抗体，室温旋转孵育30 min；将每管短暂离心后置于磁力架上，弃上清，每管加0.5 mL RIP洗涤缓冲液，涡旋后置于磁力分离器上，弃上清液；重复洗涤1次；置于冰上。

1.4.3 RIP 制备适量含RIP洗涤缓冲液、0.5 mol/L EDTA、RNase抑制剂的RIP反应液。磁珠放磁力架上，弃上清液，每管添加900 μL RIP反应液；将第Ⅰ部分的RIP裂解上清液迅速解冻，4℃、12 000 r/min离心10 min，将100 μL上清液加入磁珠-抗体中，使每管RIP反应液达到1.0 mL；从第Ⅰ部分的RIP裂解上清液中取出100 μL提取RNA，此部分为总RNA（或input RNA）；4℃旋转孵育3 h或过夜，短暂离心，置于磁力分离器上，留存上清，提取RNA，此部分RNA为未结合RNA（unbound RNA）；加入0.5 mL冰冷的RIP洗涤缓冲液，涡旋后置于磁力分离器上，留存上清液；重复此步5次，共6次，标记为W1～W6；第 6 次重悬后，取磁珠悬液 50 μL 用于Western印迹，验证Hfq蛋白在磁珠上。

1.4.4 RNA的纯化 用蛋白酶K溶液重悬磁珠，55℃消化10 min；再用TRizol法抽提RNA，用乙醇沉淀，此部分RNA为结合RNA（bound RNA）。

1.5 Western印迹

15%SDS-PAGE后转膜（PVDF膜，5 mA/cm2，2 h）；封闭，10 mL 5%脱脂奶粉，轻轻振荡，4℃过夜或室温3 h，一抗孵育，用封闭液1∶10 000稀释，室温振荡孵育1 h或4℃过夜；TBST洗膜3次，10 min/次；二抗孵育，加入羊抗鼠二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温振荡孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次；显色，1 mL A液+1 mL B液，充分混匀，全部滴加在PVDF膜上，使整张膜全部浸入显色底物反应5 min；压片和显影，压片 3～5 min，放入显影液 1～2 min，用水冲洗几次，放入定影液1 min，取出X线胶片，用自来水冲洗、晾干；观察结果，扫描图片。

1.6 Northern印迹

6% 尿素-PAGE后转膜［BrightStar-Plus膜，半干式转膜仪 50 mA 电转，4℃，45 min（8 cm×4 cm）］；紫外交联，120 mJ/cm2能量交联；杂交，65℃，预杂交时间为1～2 h，正式杂交过夜（12～18 h）；高、低严谨洗涤，用低严谨洗液室温洗2次，每次5 min，再用高严谨洗液65℃洗2次，每次15 min；洗脱、封闭和免疫检测，用洗涤缓冲液洗膜1～5 min后，用封闭缓冲液孵育30 min；将膜置于Anti digoxigen⁃in-AP conjugat solution（1∶20 000）中孵育20 min，再用洗涤缓冲液洗2次，每次15 min，最后在检测缓冲液中平衡3 min；加CDP-Star均匀覆盖膜，孵育5 min；用单层保鲜膜包裹，放在压片夹中，在暗室中取出柯达胶片压片1～5 min，取出胶片在显影液中显影20 s～1 min，去离子水中洗膜5～8次；定影液中定影1 min，去离子水冲洗干净、晾干，观察结果，扫描图片。

2 结果

2.1 载体构建及PCR验证

鼠疫菌的Hfq蛋白与其他细菌的Hfq蛋白一样，是一个高度保守的蛋白，且同源性非常高。我们表达Hfq蛋白，免疫小鼠和免疫家兔制备抗体，未能制备成功，因此采用在Hfq蛋白后加入Flag标签，使用Flag抗体，构建了重组载体，导入hfq缺陷株，经PCR鉴定和测序结果正确，可以使用。

2.2 生长曲线结果

鼠疫菌的Hfq蛋白与其生长有关，基于λRed同源重组系统构建鼠疫菌hfq缺陷株生长速度减慢，在hfq敲除基础上导入pACYC184-hfq-Flag质粒构建的实验菌株和在WT基础上导入pACYC184-Flag质粒构建的对照菌株生长速度都恢复了正常，与野生株没有明显差异。结果表明，互补后Hfq的功能得到了恢复，不影响下游实验，本实验构建的载体可用于RIP实验（图1）。

2.3 Western印迹

为了检测RIP实验过程中鼠疫菌Hfq蛋白的表达及其生物学活性，我们采用Western印迹，分别对细菌裂解上清、细菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、W2、W6、磁珠悬液、蛋白酶消化后的磁珠等9个样品中鼠疫菌Hfq蛋白的表达进行了检测，结果见图2，细菌裂解上清、细菌裂解沉淀、input上清、RIP上清、W1、磁珠悬液中均检测出Hfq蛋白。细菌裂解上清中蛋白的表达多于细菌裂解沉淀，说明蛋白主要集中于上清中；RIP上清中也存在蛋白，说明Hfq表达相对于磁珠是过量的；W2、W6中没有检测到，说明蛋白与磁珠结合稳定没有脱落；磁珠悬液中检测出蛋白，说明蛋白有活性，可以形成RNA/蛋白复合体，可进行后续实验。

2.4 TRIzol试剂提取RNA的质量验证

用紫外分光光度法检测WT-pACYC184-Flag和Δhfq-pACYC184-hfq-Flag等2株菌提取的RNA的D260nm/D280nm值约为2.0，说明RNA纯度较高，但并不能真正反映RNA的质量，还需要进行琼脂糖电泳观察。在样品中加50%去离子甲酰胺以维护RNA的稳定，用SYBR胶体金核染料观察结果，可见23S、16S、5S rRNA条带明亮，边缘清晰，且23S rRNA条带的亮度是16S rRNA的2倍左右，说明RNA质量良好，无降解（图3）。

2.5 Northern印迹

为了进一步验证RIP实验分离得到的RNA的性质，我们用RyhB1、RyhB2和5sRNA探针对分离到的RNA进行Northern印迹，主要检测总RNA、结合RNA（磁珠上提取得到）、未结合RNA（RIP上清中提取得到）等3部分RNA，它们的上样量均为1.5 μg。结果如图4，3种探针均可检测出RNA，说明鼠疫菌sRNA RyhB1和Ryhb2都可以和Hfq结合；未结合RNA检测到条带，说明Hfq蛋白相对于磁珠抗体过量。

3 讨论

图1 4株鼠疫菌在LB培养基和TMH培养基中的生长曲线

鼠疫是一种自然疫源性疾病，其特点是发病急、传播快和病死率高，是国家法定的甲类传染病。近年来鼠疫的感染呈上升趋势，已被世界卫生组织（WHO）列为重新抬头的传染病。此外，鼠疫菌还是标准的生物战剂，因此鼠疫防治将是一个不可回避的问题。鼠疫菌基因表达调控机制的研究是至关重要的，在基因调控领域已不仅只关注蛋白质的调控作用，sRNA是近年发现的细菌体内的一类重要调控分子，在细菌应对环境刺激（如活性氧、温度、酸碱度等）条件下调控靶基因的表达[10]。在大肠杆菌基因组中发现并鉴定的sRNA达数十条，沙门菌中也存在大量sRNA，序列大多与大肠杆菌的同源[3]。鼠疫菌sRNA的研究还刚起步，随着高通量测序技术的发展，越来越多的sRNA将会被发现并需要验证。因此，需要建立一种安全性好、成本低廉、便于操作的sRNA检测方法。

sRNA调控基因表达的其中一种方式，是与RNA结合蛋白相互作用，从而调节蛋白的活性。我们以RNA结合蛋白Hfq为切入点，利用它们之间的相互作用来建立一种技术，发现并鉴定sRNA。采用RIP技术，用针对RNA结合蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。这种方法可以针对特异性的目的蛋白进行与其相关RNA的检测，灵敏度较高，可以定性发现鉴定RNA，为揭示RNA和蛋白的作用机制奠定了基础。

图2 Western印迹检测鼠疫菌Hfq蛋白

图3 RNA质量检查

图4 鼠疫菌RyhB探针Northern印迹检测

影响RIP实验结果的因素很多，包括Hfq蛋白表达量、标签活性、抗体纯度、抗体高亲和力、RNA酶污染等因素。Hfq蛋白表达量、标签活性和抗体质量是决定实验是否成功的基础。本研究中Hfq蛋白的表达过量，主要是由于蛋白在体内的表达无法控制，因而免疫共沉淀后还有大量蛋白存留，影响该技术的特异性。标签活性和抗体质量是免疫沉淀的基础，要严格控制。另外，整个实验过程中都要注意防止RNA酶污染。

RIP技术可用于其他mRNA的鉴定和检验，也可以直接结合下游应用，包括定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、芯片分析（RIP-chip）和深度测序或二代测序技术（RIP-Seq），与这些技术结合，能帮助我们更高通量地了解整体水平的RNA变化。由于不能直接鉴定RNA结合蛋白在RNA内部的识别元件，可以通过紫外交联免疫共沉淀-高通量测序技术（CLIP-seq）获取RNA结合蛋白的结合位点的cDNA文库，在全基因组范围内鉴定不同RNA上RNA结合蛋白的结合位点，就可以直接鉴定结合基序和机制，有利于新sRNA、新机制和新功能的发现。

Northern印迹结果显示，未结合RNA也检测到RNA。主要原因是实验中每个部分RNA的区分是相对的，由于Hfq蛋白表达相对于磁珠上抗体是过量，所在RIP后上清中会残留过量蛋白，因此我们提取未结合部分RNA时存在结合的RNA残留，导致Northern印迹检测在未结合RNA处有条带。

本研究以Hfq为靶点，以鼠疫菌RyhB1和RyhB2为模型鉴定了sRNA的存在与Hfq相互作用，为其他RNA的体内验证提供了可借鉴的方法。本研究使用的标签抗体策略，对某些难以获得高纯度抗体的RNA结合蛋白研究同样具有借鉴意义。

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