局部亚低温对大鼠脑缺血再灌注基质金属蛋白酶9及细胞外基质蛋白表达的影响

李 芳 刘向荣 闫 峰 张陈诚 罗玉敏 方伯言 吉训明*

(1.辽宁医学院研究生院，辽宁锦州 121001;2.首都医科大学宣武医院脑血管病研究室，北京 100053;3.航天中心医院神经内科，北京 100049)

随着人口老龄化的到来，缺血性脑血管病的发病率逐年上升，给家庭及社会带来了沉重的负担。目前对缺血性脑血管病的公认有效治疗方法仍为超早期溶栓治疗，但溶栓后不可避免地造成脑缺血再灌注损伤。亚低温是指维持组织处于32℃ ～34℃，国内外研究［1-2］发现亚低温可以通过多种途径减轻脑缺血再灌注后损伤。脑缺血再灌注损伤可造成血脑脊液屏障(blood-brain barrier，BBB)的显著破坏。

基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)主要作用于胶原(Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ)和层黏连蛋白(laminin，LN)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分［3］，可导致 BBB 的损伤。LN和FN是基底膜的组成部分，是维持BBB完整性的重要蛋白质。严重的BBB破坏可以导致血管源性的脑水肿、颅内高压和脑缺血后致命性的出血转化［4］。

本实验主要探讨局部亚低温处理对大鼠脑缺血再灌注损伤时MMP9、LN及FN表达的影响，探明局部亚低温是否通过改变MMP9、LN及FN的表达来发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取清洁级、成年健康雄性SD大鼠45只，体质量280～310 g，由首都医科大学宣武医院动物实验室提供并饲养。实验动物许可证号:SCXK(京)2008－0001。

1.1.2 主要试剂及仪器

2，3，5－氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)购自美国 Amresco公司，MMP9兔源多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，FN和LN兔源多克隆抗体购自英国Abcam公司。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate，TRITC)标记的山羊抗兔荧光二抗为美国Jackson Immuno Research Laboratories公司产品。含4'，6－二脒基－2－苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片剂购自美国Invitrogen公司。荧光显微镜Nikon 80i为日本Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立

改良线栓法［5］制作大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血时间为2 h。模型制作采用数字表法随机分7组:①假手术组(sham组，n=5);②正常体温再灌注4 h对照组(N-4 h组，n=5);③局部亚低温再灌注4 h组(H-4 h组，n=5);④正常体温再灌注24 h对照组(N-24 h组，n=10)⑤局部亚低温再灌注24 h组(H-24 h组，n=10);⑥正常体温再灌注72 h对照组(N-72 h组，n=5);⑦局部亚低温再灌注72 h组(H-72 h组，n=5)。

大鼠称体质量后，5%恩氟烷诱导麻醉，2%恩氟烷混合70%N2O及30%O2维持麻醉。取颈部正中切口，分离右侧颈外动脉和颈内动脉。于颈外动脉远端1.5 cm处结扎、电灼、切断其相应分支。将头端直径0.26 mm线栓由右侧颈外动脉断端经颈总动脉分叉至右侧颈内动脉，缓慢进线至有轻微阻挡感，此时线栓头端位于右侧大脑中动脉开口处。栓塞2 h后，取出线栓，电凝颈外动脉断端。局部亚低温再灌注组于缺血即刻在大鼠头部放置冰块，测温探头插入颞肌中，监测脑温维持于32.5℃ ～33.5℃，并持续至再灌注后1 h，低温共持续3 h，自动控温电热毯使肛温维持于36.5℃～37.5℃。正常体温再灌注组除头部不放置冰块，其余均与局部亚低温再灌注组一致。假手术组只分离暴露血管，不结扎颈外动脉，不插入尼龙鱼线。分别于再灌注4 h、24 h和72 h时处死大鼠，收集标本。假手术组于手术后24 h处死，取标本。

1.2.2 脑梗死体积测定

缺血再灌注24 h组大鼠经腹腔注射10%水合氯醛2 mL，诱导过度麻醉后，迅速断头取脑，横断面由前向后，取视交叉前4 mm及其后大脑做连续冠状切片(层厚2 mm)，共取6片。将切片置于1.5%TTC溶液中，37℃避光孵育至大脑切片着色。TTC染色后可见正常脑组织呈成红色，梗死组织不着色。以Image J软件画图分析计算梗死体积比(%)。梗死体积比(%)=(健侧大脑半球体积－梗死侧非梗死区大脑半球体积)/健侧大脑半球体积×100%。健侧大脑半球体积=(A1+A2+……+A6)×H。梗死侧非梗死区大脑半球体积=(A1'+A2'+……+A6')×H。其中，An表示每张脑片健侧大脑面积，An'表示每张脑片梗死侧非梗死区大脑面积，H表示脑片厚度。

1.2.3 大鼠神经功能测定

神经功能测定采用Ludmila Belayev12分评分法［6］于再灌注24 h进行。(1)姿势反射测验，即提尾悬空试验:无明显神经功能缺失为0分，梗死对侧肢体屈曲为1分，侧推试验阳性为2分。(2)前肢放置试验:①视觉亚实验，即前方刺激。实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近(此时桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反应为前肢即刻抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0分:动物肢体放置反应正常;1分:反应延迟但不超过2 s;2分:反应延迟且超过2 s。侧方刺激，此时桌子位于动物侧方，其余实验方法及评分标准同前方刺激。②触觉亚实验，将动物双眼遮住，并使其前爪悬空，此时大鼠既看不见，也不能用胡须触及桌面，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达皮肤和毛发，动物反应及评分同视觉亚实验，触觉刺激同样分前方及侧方刺激。③本体觉亚实验，操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同，本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节。该亚实验只有前方刺激。前肢放置实验总分范围0～10分，神经功能缺损越重，得分越高。

1.2.4 免疫荧光测定各组大鼠MMP9、FN及LN的表达

大鼠断头取脑，4%多聚甲醛(pH 7.0)固定48 h，以2 mm层厚将鼠脑均匀切为5片。常规脱水、透明、石蜡包埋后在切片机上连续冠状切片，片厚4 μm。组织切片依次进行二甲苯脱蜡、下行梯度乙醇水化，0.3%H2O2/甲醇溶液10 min消除内源性过氧化物酶活性，20 mg/L蛋白酶K室温作用30 min修复抗原，3%小牛血清室温封闭30 min阻止抗原非特异性结合后，一抗湿盒中4℃孵育过夜。荧光二抗室温孵育30 min后，DAPI封片，显微镜下观察。阴性对照除未用一抗孵育外，其余与上述步骤一致。抗体稀释比例如下:MMP9(1 ∶50)，LN(1 ∶525)，FN(1 ∶540)，TRITC标记的山羊抗兔二抗(1:200)。采用Carl Zeiss公司的图像分析器检测缺血半暗带区域MMP9、LN和FN的免疫荧光强度，采用-log(检测区域的大脑吸光度/阴性对照吸光度)进行分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量数据以均数±标准差(x ±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，均数两两比较采用Student Newman Keuls法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死体积测定结果

TTC是1种水溶性盐类物质，可以与细胞内线粒体脱氢酶反应生成深红色脂溶性物质。缺血2 h再灌注24 h组大鼠右额、顶叶皮质和基底节等缺血区因线粒体脱氢酶失活不染色呈苍白色，周围正常组织染成均匀的深红色。TTC染色结果经Image J软件分析，H-24 h组的脑梗死体积(18.34±7.06)%较N-24 h组(37.12±4.61)%减小，2组差异具有统计学意义(P=0.007)。详见图1。

图1 脑梗死体积结果Fig.1 Results of cerebral infarction volume

2.2 大鼠神经功能测定结果

与N-24 h组(8.30±1.16)相比，H-24 h组神经功能评分(6.50±1.43)显著降低(P=0.006)，神经功能明显改善，详见图2。

图2 神经功能评分结果Fig.2 Results of neurologic deficits score

2.3 免疫荧光检测MMP9结果

H-4 h组、H-24 h组大鼠脑组织MMP9表达均降低，与N-4 h组、N-24 h组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，详见图3。

2.4 免疫荧光检测LN及FN结果

给予局部亚低温处理，H-4 h组大鼠脑组织LN及FN表达均较N-4 h组升高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。详见图4。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应过程［7］。在缺血再灌注过程中，BBB结构和功能常遭破坏。BBB由内皮细胞、内皮细胞间的紧密连接、包绕血管的星形胶质细胞足突、周细胞及其间的基底膜等形成并维持其功能［8］。毛细血管外周的ECM泛指细胞分泌的以基底膜或不定形式存在于细胞外间隙的分子，主要有IV型胶原、LN、FN、硫酸乙酞蛋白多糖等，对血液中的物质经过内皮细胞进入脑起了电荷屏障和分子筛的作用。BBB破坏基础上ECM的构成变化，可以直接影响神经系统疾病的演变［9］。

Rosenberg等［10］研究发现缺血再灌注损伤后数小时BBB开放，但此时的开放是短暂的，随后24 h至48 h BBB有一个更严重的破坏。我们发现，与假手术组比较，正常体温再灌注4 h MMP9表达即增加，24 h达高峰，这与血脑脊液屏障的第2次开放时间一致，表明MMP9可能参与血脑脊液屏障的破坏。而局部亚低温再灌注4 h组MMP9表达无明显增加，提示局部亚低温在缺血再灌注早期即可抑制MMP9的表达。局部亚低温再灌注24 h、72 h组MMP9表达虽较假手术组增加，但分别较正常体温再灌注24 h、72 h组表达下降，说明局部亚低温处理可在缺血再灌注4 h～24 h明显抑制MMP9的表达。同时，局部亚低温处理再灌注24 h可减少脑梗死体积，改善大鼠神经功能，提示局部亚低温处理可能在缺血再灌注早期通过抑制MMP9的表达发挥神经保护作用。目前，局部亚低温处理导致MMP9表达下调的机制还没有确切报道。肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)可以刺激周细胞释放MMP9［11］，局部亚低温处理缺血再灌注模型后，TNF-α表达是否有变化，待于进一步研究。金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)可以调节 MMP9的活性。其中，TIMP-1优先与MMP9特异性结合，形成可溶性非共价复合物而发挥其抑制作用［12］。已有研究［13］证明，缺血后低温处理可以增加内源性TIMPs的水平，表明局部亚低温处理有可能是通过增加TIMP-1表达从而抑制MMP9的活性来发挥神经保护作用。

LN主要由内皮细胞和上皮细胞合成与分泌，与Ⅳ型胶原特定位点结合形成复杂立体结构，维持基底膜正常功能和稳定结构，对BBB的功能和完整性有重要作用［14］。FN广泛存在于细胞表面、结缔组织、细胞外液和大部分的基底膜上，是ECM的重要组成部分。细胞表面及ECM中的FN分子间通过二硫键相互交联，组装成纤维，维持细胞和基底膜的功能［15］。FN和LN在基底膜内起支持作用，可防止由于静水压和渗透压改变引起的血管变形［3］。MMP9在缺血再灌注损伤早期通过降解细胞外基质成分，包括IV型胶原、LN、FN和内皮紧密连接的闭锁小带，导致BBB的破坏。正常体温再灌注4 h组LN和FN表达较假手术组显著减少，而局部亚低温再灌注4 h组LN和FN表达较正常体温再灌注4 h组显著增加，提示缺血再灌注可以减少LN和FN的表达，局部亚低温处理则可在缺血再灌注早期抑制LN和FN降解。局部亚低温在缺血再灌注早期可抑制MMP9的表达，表明局部亚低温处理早期可通过抑制MMP9表达，从而抑制其对LN和FN的降解发挥神经保护作用。局部亚低温再灌注24 h组MMP9表达也明显较正常体温再灌注24 h组下降，而此时LN和FN表达与后者比较差异无统计学意义，是由于样本量较少所致误差，还是二者表达还受MMP9外其他因素影响，有待于进一步研究。

综上所述，局部亚低温可能通过抑制缺血再灌注后MMP9的表达，增加LN和FN的表达发挥神经保护作用。

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