大鼠局灶性脑缺血后神经功能评分与脑梗死体积相关性分析

王荣亮 刘小蒙 张 营 吉训明 罗玉敏

(首都医科大学宣武医院脑血管病研究室 北京市老年病医疗研究中心，北京 100053)

线栓阻断法制作的大鼠局灶性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型是研究脑缺血再灌注最为常用的模型。损伤后脑梗死体积及神经功能损伤的评定是目前判定此模型成功的关键，也是研究脑缺血治疗药物及方法的主要观察指标。然而，大鼠脑缺血再灌注后的脑梗死体积和神经功能缺损程度是否存在相关性，是否可以通过神经功能缺损程度的评定来评判脑梗死的严重程度，目前报道的不多［1-2］。

本研究的目的在于探讨线栓阻断法制作的局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的神经功能评分与脑梗死体积相对百分比的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制作

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠20只，体质量为280～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证:SCXK(京)2009－0001。随机分笼饲养，维持室温20～22℃，术前禁食，但自由进水。通过随机数字表以简单随机化方法将大鼠按不同时间点分为5 组:缺血再灌注后 24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 组，每组4只。将头端直径为0.25 mm的线栓浸泡在肝素中备用。本实验的大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型制作方法参考Zea Longa法［3］，稍作改变，具体操作如下:大鼠称体质量后，用体积分数4% ～5%的恩氟烷诱导麻醉，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2维持麻醉。将大鼠仰卧于手术台上，取颈部正中切口，小心分离皮下脂肪和肌肉，右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA);分离ECA主干，钝性分离出甲状腺动脉和枕动脉，并电灼切断。在CCA分叉处远端约1 cm处结扎、电灼、切断ECA，用动脉夹临时夹闭CCA和ICA，用眼科剪在ECA残端剪一切口，插入线栓，结扎缝合线，松开ICA动脉夹，缓缓推动线栓进入ICA入颅动脉支。线栓穿过距ICA和ECA分叉处约20 mm左右，有阻力感时放开CCA动脉夹，结扎CCA分叉处缝合线，缝合皮肤。缺血2 h后，再次麻醉大鼠，打开颈部切口，将线栓拔出，电凝ECA残端后缝合颈部切口，即完成大鼠脑缺血2 h再灌注损伤模型。

1.2 神经功能评分

用以下三种评分方法分别在脑缺血再灌注24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 后进行神经功能评分。

(1)Longa评分法［3］评分标准为:采用 Longa等推荐的5分法，并稍作改进，对大鼠神经功能进行评分，0分:正常;1分:脑缺血对侧的前肢不能伸展;2分:脑缺血对侧的前肢屈曲;3分:实验动物向缺血对侧轻度转圈;4分:实验动物明显向缺血对侧转圈;5分:实验动物爬行时向缺血对侧倾倒。

(2)前肢踩空试验(forelimb placing test)［4-5］:反映实验动物的视觉、触觉以及前肢对感觉及运动的整合能力。将由正方形网格(3 cm×3 cm)组成的1米长的架子放置在离地面1米的高度，让大鼠在1 min之内由架子一端爬过另一端，爬行过程中前肢掉入网格里1次记为1分。计算1 min之内，爬行中大鼠脑缺血对侧前肢掉入网格里的总次数。

(3)Ludmila Belayev 12分评分法［6］:1)姿势反射试验，即提尾悬空试验:无明显神经功能缺失为0分，梗死对侧肢体屈曲为1分，侧推试验阳性为2分。2)肢体放置试验:①视觉亚实验，实验者将动物握于手中，使其前爪悬空，让动物位于桌子前方，自桌面上方10 cm处向桌面缓慢斜线靠近，大鼠正常反应为前肢即抓向桌面，损伤大鼠则表现为肢体反应延迟。0分:动物肢体放置反应正常;1分:反应延迟但不超过2 s;2分:反应延迟且超过2 s。侧方刺激，让动物位于桌子侧方，实验检测方法及评分标准同前方刺激。②触觉亚实验，将动物双眼遮住，并使其前爪悬空，用其前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅达皮肤和毛发，动物反应及评分同视觉亚试验，触觉刺激同样分前方和侧方刺激。③本体觉亚实验，操作及评分同触觉亚实验，仅刺激深度不同，本体觉亚实验给予前爪较大压力，刺激深达肌肉及关节。该亚实验只有前方刺激。动物前肢放置试验总分范围为0～10分，功能损伤越重，得分越高。

1.3 HE染色测定脑梗死体积

各组大鼠分别在脑缺血2 h再灌注24 h、3 d、7 d、14 d、30 d后，10%水合氯醛腹腔麻醉，右心室快速灌注肝素化磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)并用4%多聚甲醛进行固定，断头取脑，置4%多聚甲醛中后固定48 h后放入模具，于视交叉处沿冠状切片，向前囟方向切2张切片，向小脑方向切3张切片，每片厚约2 mm，石蜡包埋、切片。每片脑组织做HE染色，数码相机拍摄，使用Image-Pm Plus 6.0图像分析系统计算脑梗死体积。大鼠脑梗死百分比=(正常侧大脑半球体积－梗死侧非梗死区大脑半球的体积)/正常侧大脑半球体积%=［(S1'+S2'+…+Sn')H-(S1+S2+…+Sn)H］/(S1'+S2'+…+Sn')H%［8］，Sn'表示每片正常脑组织面积，Sn表示梗死侧非梗死区每片脑组织面积，H表示每片厚度。

1.4 统计学方法

利用SPSS 16.0软件进行神经功能评分与脑梗死体积相对百分比分析处理，计量数据用均数±标准差(x ±s)表示。组间比较用One-way ANOVA，用Pearson相关系数描述神经功能评分与脑梗死体积相对百分比的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死体积与神经功能缺失变化趋势

线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型的大鼠在脑缺血再灌注后24 h到30 d，三种神经功能评分均有所降低(Longa 5分法从2.5±0.58降到1.25±0.5;前肢踩空试验从5.5±1.92降到3.25±1.26;Ludmila Belayev 12分法从6±1.41降到2.75±1.89)，但脑梗死体积相对百分比降低的趋势很弱(从脑缺血再灌注后24 h的51.9±4.09到7 d的50.89±3.62，再到 30 d 的 44.63±2.74)(图 1)，比较各组之间脑梗死体积相对百分比，差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。在三种神经功能评分中，缺血再灌注后7 d组与30 d组的前肢踩空试验及Ludmila Belayev 12的评分结果分别相比较，差异有统计学意义(P＜0.05，表 1、图 2、3)。

图1 不同时间点HE染色结果Fig.1 HE staining at different time points

表1 各时间点大鼠脑梗死体积相对百分比及神经功能评分结果Tab.1 Comparison of infarct volume and neurological deficit scores(±s，n=4)

表1 各时间点大鼠脑梗死体积相对百分比及神经功能评分结果Tab.1 Comparison of infarct volume and neurological deficit scores(±s，n=4)

*P＜0.05 vs 7 d group.

Item 24 h 3 d 7 d 14 d 30 d P Infarct volume/% 51.90±4.09 42.70±10.48 50.89±3.62 43.92±9.63 44.63±2.74 0.248 Longa 2.50±0.58 2.00±0.82 2.25±0.50 1.50±0.58 1.25±0.50 0.056 Forelimb placing test 5.50±1.92 5.50±1.74 6.50±1.00 5.50±0.58 3.25±1.26* 0.032 Ludmila Belayev 12 6.00±1.41 5.75±2.06 7.00±2.16 6.00±1.41 2.75±1.89* 0.033

2.2 脑梗死体积与神经功能缺失相关性分析

在神经功能评分与脑梗死体积相关性分析中，缺血再灌注后3 d组Ludmila Belayev 12分法评分结果与脑梗死体积相对百分比呈非常显著相关性(r=0.991，P＜0.01);缺血再灌注后 30 d组 Ludmila Belayev 12分法评分与脑梗死体积相对百分比呈显著相关性(r=0.951，P=0.049)。其余各组在各时间点与三种神经功能缺失评分均无相关性。

3 讨论

神经功能缺失评分作为中风的一项终点指标，越来越受到医生和研究人员的重视。在临床前研究中，应用神经功能缺失评分对动物模型进行评价，如运动功能、本体感觉、视觉功能等，是判断模型建立成功的重要依据，也是药物研究中观察的最重要指标之一。国际中风治疗临床前研究指南(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR)(2009)指出［7］:在脑缺血药物研究中应选择多重指标，评价应包括组织学和行为学的结果;且无论组织学还是行为学的研究都应包括中风后两到3周或更长时间中获得的数据。在临床神经功能损伤评分中，往往会综合评价神经功能多方面的损伤情况。如美国国立卫生院神经功能缺损评分(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)，要求对整体意识水平、感觉、视觉、运动、共济等方面进行综合评价［8-9］。目前评定脑缺血动物神经功能和行为的方法都有所提高，但是依然存在问题。如有些研究往往偏于运动功能，忽视了感觉功能，不能全面的反应神经损伤程度［10］。在神经功能缺失评分与梗死体积相关性方面已有一些研究，但观察时间持续较短［2］，采用的神经功能评分方法也不全面［11］。本实验采用三种神经功能缺失评分法对大鼠脑缺血再灌注后的 24 h、3 d、7 d、14 d、30 d 五个时间点进行功能评价和组织学损伤之间的相关性研究，相对全面地分析大鼠MCAO后远期组织变化与功能变化趋势。

Wahl等［12］利用大脑中动脉电凝法制备大鼠脑缺血模型，并评价模型的梗死体积和神经功能，研究结果表明，神经功能损伤和组织学检查相关性不明显。在最近的研究中，Chauveau等［13］用核磁共振成像及TTC染色检测大鼠脑梗死体积，结果显示缺血再灌注后24 h内神经功能缺失评分与脑梗死体积无相关性。同样的情况亦出现在本实验中，大鼠脑缺血再灌注后24 h组的三种神经功能评分与梗死体积均没有相关性，并且随着时间的延长，神经功能评分逐渐改善，但梗死体积变化不大。以上研究均表明大鼠运动功能的改善，并非是梗死损伤减弱的结果。

本研究结果表明，三种评分方法总的变化趋势是随时间延长功能逐渐改善。前肢踩空实验和Ludmila Belayev 12分评分法能较全面反映损伤后的运动、感觉及反射情况，其变化趋势是大鼠脑缺血再灌注后3 d神经功能有所好转，7 d稍有恶化，14 d及30 d评分大幅度降低，神经功能出现明显好转。前肢踩空实验和Ludmila Belayev 12分评分法在大鼠脑缺血再灌注后第7 d和30 d差异有统计学意义，各组之间Longa评分法差异无统计学意义。第3 d功能好转的原因可能是由于手术造成的梗死之外的损伤及水肿逐渐消除，此时Ludmila Belayev 12分法评分结果与脑梗死体积呈显著相关性。脑缺血再灌注后第7 d神经功能恶化原因可能是迟发型的神经元损伤(主要是白质轴突损伤)及再发性水肿引起的，14 d和30 d的功能恢复表明大鼠的大脑中动脉主干阻塞不像人类那样产生持续的偏瘫和偏身感觉缺失，这可能和大鼠的运动和感觉皮质更为原始有关，也可能是因为啮齿类动物自身神经再生修复性强。Fisher等［7］提出，一些功能评价方法在动物脑梗死后期均有自发性好转倾向，因为大多数动物模型是年轻健康的动物制作的，这种情况在人类中也有发生，但是会弱很多。

虽然本研究监测了MCAO后远期神经功能，但也有自身的缺陷。实验中各组中的动物数量太少，存在验证效能偏低的情况，导致阴性结果存疑的可能性。并且实验过程中并未进行脑血流的动态检测或者使用影像学方法测定其梗死部位，在统计HE染色后的梗死统计时并未依据梗死部位进行具体分析。另外，本研究显示Ludmila Belayev 12分评分法只能在某些时间点和梗死体积相关(缺血再灌注后3 d及30 d)，因此仍然需要寻找新的评分方法或者改良之后的评分方法，使之更贴切的反应临床表现。

为了更好的反应脑组织的损伤程度，提高神经功能的准确性，在制作模型的过程中可以考虑以下几个因素:①依靠动态检测和影像学辅助综合评价。可将神经功能缺损评分、经颅多普勒及影像学等检查(如头颅CT、MRI、PET等)结合在一起来判定，这样可使评判结果更客观。也可应用激光多普勒血流测定仪(laser doppler flowmetry，LDF)在造模期间进行血流监测［14-16］;另外，MRI具有空间分辨率高的明显优势，而且能够准确定位活体缺血发生的部位，能够在相同神经功能评分情况下区分缺血损伤的具体部位，依此为依据可进一步提高评分的准确性［13，17］。②实验动物种属选择对神经功能评分的影响［18］。Walberer等［19］发现再灌注对不同鼠种(Wistar和SD)能够产生不同的效应，再灌注能够使SD大鼠脑缺血体积明显减小。Encarnacion等［20］研究表明，SD大鼠的脑梗死的体积与血流阻断的时间相关，而Wistar则与之不相关。③对梗死脑组织不同的部位进行相关性分析。大鼠大脑中动脉供应大鼠皮质的侧面和各种皮质下结构，特别是尾状核壳核，这些皮质和纹状体结构参与感觉和运动功能。Zansinger等［21］制作SD大鼠90 min MCAO脑缺血再灌注损伤模型，每天进行神经行为学评分，缺血后一周用HE染色观察脑皮质和基底节梗死形态，结果发现神经功能评分与缺血后2 d后皮质梗死体积显著相关，缺血后3 d后与整个梗死体积显著相关。④脑梗死部位对神经功能评分的影响。He等［22］发现在一部分线栓未能经颈内动脉足够深入以阻断大脑中动脉血流时，由于颈内动脉的分支脉络膜前动脉被阻塞也能够引起神经功能的改变，此时神经功能评分的可靠性受到干扰。同样为颈内动脉分支的下丘脑动脉供血区梗死表现为无或有轻度姿势反射异常。而包含有内囊的分支脉络膜前动脉供血区梗死能够引起与梗死体积不相匹配的功能缺陷。也就是说除了皮质损害，重要的皮质下结构(尤其是纤维传导束所经过的结构)受损同样能够出现神经功能的异常。因此，对脑缺血受累部位的准确定位显得尤为重要。评价大脑不同部位的损伤与各种神经功能损伤间的相关性，将成为一个重要的研究方向［23-25］。

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