HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

李桂秋，王 颖，陈淑兰，王少玲，刘 倩，宋熙瑶，路 娟*

(1.哈尔滨医科大学第一附属医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150001;2.哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150001)

HBV感染是引起急慢性肝炎的主要病因，每年全世界约有100万人死于HBV相关性疾病。目前，核苷类似物，如拉米夫定一直用于临床慢性HBV感染的治疗［1］。然而，拉米夫定用于临床慢抗HBV治疗需要很长的治疗周期，从而导致了耐药株的产生。因此，迫切需要研究出更高效的抗HBV治疗方案。基于逆转录环节在HBV复制中的重要作用，一些学者已经证实RNA干扰可以通过沉默病毒基因来抑制HBV复制，这为抗HBV慢性感染提供了一种新的方法。我们曾经报道过针对HBV核定位信号区的siRNA能够有效抑制HBV DNA复制［2］。因为HBV感染是多基因参与的细胞内感染过程，联合使用siRNA能够发挥更强的抗HBV作用。本实验中在HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA来抑制HBV复制，实验结果表明联合应用siRNA比单独应用siRNA产生更强烈的抑制HBV复制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，G418购自美国GIBCO公司，HepG2.2.15细胞为本实验室保存，质粒 psi/U6由武汉晶赛公司提供，所有PCR引物由上海博雅生物公司合成，Trizol、M-MLV逆转录酶、Lipofection 2000购自美国Invitrogen公司，本实验中所用限制性内切酶购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 构建质粒表达载体 在质粒psil/U6的BamHⅠ-HindⅢ位点之间插入一段21 nt的编码相应shRNA的特异序列，构建了HBVshRNA的表达载体，并进一步通过BLAST分析为未发现同源序列。引物序列如下:siRNA1:5'-AAGATCTCAATCTCGGGAATC-3'; siRNA2: 5'-CAGGTCCCCTAGAAGAAGAAC-3';无关对照质粒 HK:5'-ACTACCGTTGTTATAGGTG-3'。重组质粒通过酶切和DNA序列分析加以鉴定。

1.2.2 细胞培养和转染 HepG 2.2.15细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中 (含青霉素 100 U/mL，链霉素 100 μg/mL，G418200 μg/mL)，37℃，体积分数为5%CO2的孵箱中培养。转染前24 h将细胞置于6孔板培养，4 μg表达相应siRNA的质粒与脂质体Lipofectamine 2000按说明书步骤共转染，每24 h更换培养液，分别于48、72、96 h收集细胞做进一步分析，实验分为5组，每组设3个复孔。

1.2.3 HBsAg和HBeAg的检测 用ELISA方法测定48、72、96 h细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达，具体方法按照说明书进行。

1.2.4 HBV mRNA的检测 分别于48、72、96 h用Trizol法从细胞中提取RNA，用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应。PCR循环参数如下:94℃变性3 min;变性94℃ 15 s，退火52℃30 s，延伸72℃ 30 s，循环30次，最后72℃延伸10 min结束反应。PCR引物如下:HBV上链引物:5'-ACCTCTGCCTAATCATCTC-3'，下链引物:5'-GTAAGACAGGAAATGTGAAAC-3';β-actin上链引物 5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'，GAPDH下链引物5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'。PCR扩增产物用1.2%的琼脂糖进行电泳。

1.2.5 HBV DNA的检测 分别于48、72、96 h从细胞培养上清中提取HBV DNA进行实时定量PCR检测，具体方法按照说明书进行。

1.2.6 统计学方法 所得数据采用 SPSS 12.0软件，统计处理以每组3个复孔测定值的mean±SD表示，组间比较用F检验和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HepG2.2.15细胞中 HBsAg和 HBeAg的抑制作用

用ELISA方法测定48、72、96 h细胞培养上清中HBeAg和HBsAg的表达，HBeAg和HBsAg的浓度。如图1所示，在各个时段，无关对照组对HBsAg和HBeAg的表达与空载体组相比无明显差异 (P＜0.05)，说明RNAi作用是特异的。在各个siRNA治疗组，HBsAg和HBeAg水平均有明显下降，转染96 h后联合应用siRNA组对HBsAg和HBeAg的抑制率最强 (83.89%、91.07%)与单独应用siRNA组相比均具有明显差异 (P＜0.05)。

图1 siRNA对HBsAg和HBeAg水平的影响Fig.1 Inhibition of HBsAg and HBeAg expression by siRNA

2.2 HepG2.2.15细胞中HBV mRNA的抑制作用

HBV mRNA水平用RT-PCR来检测，结果显示各个siRNA治疗组均能明显降低mRNA水平，空载体组对mRNA无抑制作用。在96 h联合应用siRNA组对mRNA的抑制率最强，几乎检测不到mRNA条带，抑制效果明显高于单独应用组 (图2)。

图2 siRNA对HBV mRNA水平影响Fig.2 Inhibition of mRNA expression by siRNA

2.3 HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用

HBV DNA水平用实时定量PCR来检测，检测范围可以达到104～108拷贝。如图3所示，各个siRNA治疗组均能明显降低DNA水平，空载体组对DNA无抑制作用。在96 h，联合应用siRNA组病毒DNA拷贝数与对照组相比减少88.6%，抑制作用明显高于单独应用siRNA组(P＜0.05)。转染96 h后，各个siRNA治疗组DNA水平分别下降50.4%(siRNA1)、22.31%(siRNA2)、69.83%(siRNA1+2)。

图3 siRNA对HBV DNA水平的影响Fig.3 Reduction of HBV DNA replication by siRNA

3 讨论

RNA干扰技术为治疗HBV感染提供了新的有效方法［3］。据报道，单独应用合成的 siRNA治疗 HBV、HCV、HIV时，会引起病毒突变。为了解决这一问题，一种方法是针对病毒基因组的不同位点设计多个siRNA，另一种方法是选择相对保守的区域。最近有研究表明，联合疗法可以最大限度降低病毒载量，而成为治疗HBV感染的新方法，因此有学者将核苷类似物或IFN-α等化学药物联合应用以减少病毒含量［4-5］。基于这种方法，本研究在HepG2.2.15细胞中检测了联合应用siRNA的抗病毒效果，并与单独应用siRNA进行了比较。因为HBV感染是多基因参与的细胞内感染过程，联合使用siRNA能够同时阻断病毒基因的多个位点，使病毒难以修复，从而发挥更强的抗HBV作用。

本实验中，针对HBV核定位信号区的特异性siRNA被转染入HepG2.2.15细胞中，并对各种指标进行监测。结果显示，HBsAg、HBeAg、mRNA水平都受到抑制;同时，real-time PCR结果显示DNA水平也明显下降，这种抑制作用具有高度选择性、特异性、剂量依赖性的特点。联合应用siRNA比单独应用siRNA产生更强烈的抑制HBV复制作用。本研究证明联合应用siRNA的合理性和有效性，为临床治疗HBV感染提供了新的思路。

［1］C.Seeger，W.S.Mason.Hepatitis B virus biology ［J］.Microbiol.Mol.Biol.Rev，2000，(64):51-68.

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［4］Mohammad Khalid Parvez，Deepak Sehgal，Shiv Kumar Sarin，et al.Inhibition of hepatitis B virus DNA replicative intermediate forms by recombinant interferon-Y ［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，12(19):3006-3014.

［5］Z.H .Chen，Z.F.Xu，J.J.Ye，H.P.Yao，et al.Combination of small interfering RNAs mediates greater inhibition of human hepatitis B virus replication and antigen expression ［J］.Journal of Zhejiang University Science，2005，(4):236-241.