天门冬多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节作用

佟春玉，孙越春，秦学功，葛文忠，崔玉东

黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319

天门冬，百合科植物。又名天冬。性寒，味甘，微苦。作为一种传统的中药，具有养阴清热，润肺滋肾的功效。用于治阴虚发热、咳嗽吐血、肺痈、咽喉肿痛、消渴、便秘等病症［1］。多糖作为一种免疫调节和促进剂，对巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的功能都有调节作用。天门冬多糖(Asparagus cochinchinensis polysaccharide，ASP)是从中药天门冬中提取的生物活性成分，据报道具有清除自由基及抗脂质过氧化活性。近年来，研究人员发现ASP可以刺激猪和小鼠的体外T、B淋巴细胞增殖，但其在体内的实验却未见报道［2，3］。因此，本研究采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型，研究ASP对免疫抑制小鼠的保护作用，为未来ASP的临床应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Balb/c小鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，体重(20±2)g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号:SCXK(吉2003-0001)。

1.2 实验试剂

ASP购自西安斯诺特生物技术有限公司，刀豆蛋白A(Con A IV型)、脂多糖(LPS)、环磷酰胺(CTX)均为Sigma产品;细胞因子试剂盒购于美国Biolegend公司，RPMI-1640完全培养基(含100 IU/mL青霉素、100 g/L链霉素、1%谷氨酰胺和10%灭活新生胎牛血清，pH 7.2)为Gibco产品;胎牛血清、DMSO、生理盐水均是国产产品。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药

小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，对照组(生理盐水)，模型组，天门冬多糖高、中、低剂量组，连续给药7 d，给药第3 d，除对照组外，其他各组小鼠均腹腔注射CTX 50 mg/kg，连续3 d，建立免疫抑制小鼠模型。

1.3.2 脏器指数测定

7d后，称重，颈椎脱臼处死小鼠，分离胸腺和脾脏称湿重，以小鼠胸腺或脾脏重/体重(mg/g)作为胸腺指数或脾脏指数。

1.3.3 免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖反应测定

无菌条件下制备Balb/c小鼠脾细胞悬液加入到96孔板中，每孔100 μL，调整脾细胞浓度为5×106个细胞/mL，此后，加入 Con A(终浓度 5 μg/mL)或 LPS(终浓度 20 μg/mL)100 μL，使终体积为200 μL并各设三个复孔。96孔板置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养44 h后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL)再继续培养4 h。4 h后移除培养液，每孔加入150 μL DMSO震摇10 min，在570 nm测量吸光值。

1.3.4 免疫抑制小鼠血清细胞因子含量的检测

小鼠第7 d给药后摘除眼球取血并分离血清，采用双抗体夹心ELISA法测定血清IL-2和IL-4含量，参考试剂盒使用说明书步骤操作，于450 nm波长处检测吸光度，根据浓度标准曲线计算IL-2和IL-4含量。

1.3.5 统计分析

所有数据均用SPSS 13.0统计软件包进行处理，数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，资料进行正态性检验;多组计量资料采用one-way ANOVA，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T3法。P＜0.05有统计学意义。

2 实验结果

2.1 ASP对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

ASP对脾脏指数的影响如表1所示，与空白组相比，CTX组的胸腺指数和脾脏指数显著降低，而ASP各剂量组的胸腺指数脾脏指数明显升高(P＜0.01)，说明ASP在一定的剂量范围内可以缓解CTX对小鼠的免疫抑制作用。

表1 ASP对CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

表1 ASP对CTX引起的免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s)Table 1 Effects of ASP on thymus and spleen index in immunosuppressed mice(±s)

注:与对照组相比，##P＜0.01;与CTX组相比，＊＊P＜0.01。Note:##P＜0.01vs.Control group;＊＊P＜0.01 vs.CTX group.

组别Group浓度Concentration(mg/kg)胸腺指数Thymus index(mg/g)脾脏指数Spleen index(mg/g)空白组Control Group - 2.57±0.09 5.19±0.06 CTX组CTX Group CTX(50) 1.35±0.07## 3.08±0.19##实验组 Experimental Group 10+CTX(50) 1.73±0.11＊＊ 4.20±0.18＊＊20+CTX(50) 2.16±0.09＊＊ 4.53±0.10＊＊40+CTX(50) 2.53±0.08＊＊ 4.84±0.12＊＊

2.2 ASP对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

图1 ASP对脾淋巴细胞体内增殖的影响Fig.1 Effect of ASP on splenocyte proliferation in vivo

ASP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响如图1所示。ConA或LPS刺激脾淋巴细胞会引起细胞增殖，而50 mg/kg的CTX能有效地抑制ConA或LPS刺激脾淋巴细胞增殖反应(P＜0.01)。与此相反，ASP加上CTX可以有效地缓解CTX对脾细胞增殖反应的抑制作用，并呈剂量依赖的方式。

2.3 ASP对免疫抑制小鼠血清细胞因子IL-2和IL-4的影响

ASP对免疫抑制小鼠血清中主要细胞因子水平的影响如图2所示，我们使用ELISA方法检测小鼠血清中的IL-2和IL-4的细胞因子水平。从图中可以看出，CTX组血清中的细胞因子IL-2和IL-4比对照组显著降低(P＜0.01);与CTX组相比，当ASP组剂量为20 mg/kg或40 mg/kg时，免疫抑制小鼠血清中的IL-2和IL-4的水平都显著提高(P＜0.01)。

图2 ASP对免疫抑制小鼠血清中IL-2和IL-4分泌水平的影响Fig.2 Effect of ASP on serum IL-2 and IL-4 of immunosuppressed mice

3 讨论

环磷酰胺为氮芥与磷酰胺基结合而成的化合物，是临床常用的烷化剂类免疫抑制剂。可用于治疗各种自身免疫性疾病，即能抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞［4］。本文采用CTX所致免疫低下小鼠模型，研究ASP对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，探讨ASP的免疫药理效应，摸索其最佳剂量范围。

众所周知，细胞有丝分裂原ConA可以刺激T淋巴细胞增殖，LPS可以刺激B淋巴细胞增殖，T淋巴细胞主要参与机体的细胞免疫反应，B淋巴细胞主要参与体液免疫反应［5-7］。在体内细胞增殖实验中，采用MTT法测定ASP对LPS和ConA诱导的淋巴细胞增殖的影响。结果显示ASP可以缓解CTX组对小鼠脾细胞体内增殖反应的抑制作用，因此说明ASP通过细胞免疫和体液免疫两种方式参与机体免疫反应，并呈现一定的剂量依赖模式。

细胞因子能介导和调节免疫应答，检测细胞因子分泌水平可以密切反映机体的免疫状态。IL-2主要由TH1细胞分泌，参与细胞免疫反应;IL-4主要由TH2细胞分泌，参与体液免疫反应［8-10］。本研究中，在CTX诱导小鼠免疫功能抑制的基础上，给予ASP，可显著增加小鼠血清中IL-2、IL-4含量。表明ASP对CTX诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定的免疫调节作用，能提高小鼠的免疫防御功能。

综上可见，ASP可以消除CTX诱导的小鼠免疫抑制作用，对临床具有一定的应用价值，未来需对ASP免疫增强机制进一步研究，为其临床应用提供科学依据。

1 Li ZX(李志孝)，Huang CG(黄成钢)，Cai YJ(蔡育军)，et al．The chemical structure and antioxidative activity of polysaccharide from Asparagus cochinchinensis.Acta Pharm Sin(药学学报)，2000，35:358-362.

2 Pan GZ(潘贵珍)，Hu TJ(胡庭俊)，Su ZJ(苏子杰)，et al．Effect of Asparagus cochinchinensis polysaccharide on proliferation of swine splenic lymphocytes in vitro.J Feed Ind(饲料工业)，2012，33:35-37.

3 Kang L(康乐)，Yao DB(姚东璧)，Hu TJ(胡庭俊)，et al．The effect of Asparagus cochinchinensis polysaccharide on proliferation of splenic lymphocytes from mice in vitro.Chin J Anim Hus Vet Med(中国畜牧兽医)，2010，37:15-17.

4 Huang XH，Hu YH，Zhao X，et al.Sulfated modi?cation can enhance the adjuvant activity of Astragalus polysaccharide for ND vaccine.Carbohyd Polym，2009，73:303-308.

5 Li R，Chen WC，Wang WP，et al.Extraction，characterization of Astragalus polysaccharides and its immune modulating activities in rats with gastric cancer.Carbohyd Polym，2009，78:738-742.

6 Lu J，Guan S，Shen X，et al.Immunosuppressive activity of 8-gingerol on immune responses in mice.Molecules，2011，16:2636-2645.

7 Contreras OM，Soldevila G，Lopez GP，et al.Role of CRTAM during mouse early T lymphocytes development.Dev Com Immunol，2010，34:196-202.

8 Shao P，Zhao LH，Zhi C，et al.Regulation on maturation and function of dendritic cells by Astragalus mongholicus polysaccharides.Int Immunopharmacol，2006，6:1161-1166.

9 Chu Y，Yan X，Li X，et al.Effect of Chinese herbalmedicinal ingredients on IL-2 mRNA levels of T lymphocytes in mice measured using semiquantification RT-PCR.Agric Sci China，2006，5:873-878.

10 Mitsias DI，Tzioufas AG，Veiopoulou C，et al.The Th1/Th2 cytokine balance changes with the progress of the immunopathological lesion of Sjogren’s syndrome.Clin Exp Immunol，2002，128:562-568.