HPLC法检测苦杏仁苷及其酶解产物

常 军

江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013

苦杏仁苷(Amygdalin)，属苯乙醇腈的β-龙胆二糖苷，是苦杏仁中的主要有效成分之一，其结构见图1。苦杏仁苷广泛存在于杏、桃、李等多种蔷薇科植物果实的种子中［1］，具有良好的抗肿瘤［2］、抗氧化作用［3］、调节免疫功能的作用［4］及镇咳平喘的作用［5］。目前对苦杏仁苷的研究主要集中在分离纯化［6］、含量检测［7］及代谢［8］及抗肿瘤药理［9］研究。本课题组在苦杏仁苷在催化转化研究中发现，苦杏仁苷在黑曲酶胞外全酶制剂的催化下，4 h内全部降解，生成4个产物，分别为杏仁腈、野樱苷、苯甲醛及一个新的化合物phenyl-(3，4，5-trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-acetonitrile(PTMT)，是野樱花苷的6位羟基取代衍生物。苦杏仁苷及其降解产物的结构如图1。本文建立了一个快速、准确的HPLC同时检测苦杏仁苷及其4个产物的方法。

图1 苦杏仁苷及其酶解产物结构图Fig.1 Chemical structures of amygdalin and its meabolites

1 材料与方法

1.1 材料

催化降解用苦杏仁苷从苦杏仁中分离纯化得到，纯度达到85%;苦杏仁苷、杏仁腈、苯由酸、野樱苷标准品均购自sigma公司，纯度98%以上;PTMT从苦杏仁苷的酶解产物中分离、纯化得到，纯度98%［10］。甲醇(Fisher)为色谱纯试剂，其它的均为分析纯试剂。

1.2 标准溶液的制备

精密称取苦杏仁苷、杏仁腈、苯由酸、野樱苷及PTMT各20 mg溶于10 mL去色谱纯甲醇中、定容得到浓度为2 mg/mL的标准溶液母液。制作标准曲线时，取25、125、250、500、750、1000 μL 母液于5 mL容量瓶中定容得到浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 及 1 mg/mL 的各标准品测试溶液，4℃冰箱中贮藏备用。

1.3 HPLC检测方法

安捷伦液相色谱系统，迪马C18ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱温箱控制在25℃，流动相30%甲醇溶液，流速1 mL/min，检测波长210 nm，进样量 10 μL。

1.4 线性关系

应用“1.3”中 HPLC 方法分析 0.01、0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的各标准品，以质量(μg)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得到回归方程。

1.5 不同温度条件下稳定性的测定

分别取浓度为0.2 mg/mL的各标准溶液5 mL置于10 mL试管中，分别置于30、40、50保温12 h，每2 h取样一次进行分析。

1.6 不同pH条件下稳定性的测定

取5支10 mL试管，各装去离子水5 mL，并用1 mol/L 的 HCl调节 pH 值为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，用移液管吸取1 mL 0.2 mg/mL各标准溶液，移入上述各试管中，25℃保温12 h，每2 h取样一次进行分析。

1.7 精密度和准确度测定

取浓度 0.1、0.4、0.8 mg/mL 的样品各2 mL，分别于同一天和隔天的采用“1.3”的HPLC方法进行检测含量，每个样品重复6次，分别计算天内和隔天的RSD和RE值。

1.8 回收率测定

黑曲霉总酶制备将黑曲霉斜面菌种接入4 L培养基(8 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，5 g/L KH2PO4，5 g/L NaCl，1 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L MnSO4·4H2O，pH 6.5)中，28℃培养5 d。发酵液用饱和(NH4)2SO4沉淀12 h后，再在4℃条件下盐析12 h，随后冷冻干燥得黑曲霉总酶。

82 U/mL的总酶溶液配制 称取黑曲霉总酶冻干粉40.3 mg，溶于10 mL水溶液中得酶溶液，得82 U/mL的黑曲霉总酶溶液。

用移液器准确移取准确移取5 mL上述黑曲霉总酶溶液，加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液钝化酶，0.1、0.5、1 mL浓度为l mg/mL各标准溶液到1 mL上述钝化酶溶液，按照“1.3”中的方法检测各成分含量，每个样品重复3次。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析方法

从图2中可看出，苦杏仁苷及其4外酶解产物色谱形为良好，样品中的杂质没有对峰的分辨率产生干扰，苦杏仁苷、PTMT、野樱花苷、苯甲醛和杏仁腈的保留时间分别为 5.087、13.836、16.357、22.775和3.307 min，样品与标准品中的相应峰保留时间一致。

图2 苦杏仁苷及其酶解产物的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of amygdalin and its metabolites

2.2 线性关系

苦杏仁苷、PTMT、野樱花苷、苯甲醛和杏仁腈的线性回归方程分别为:Y=8．94×105+3．76×103X(R=0．9998)，Y=4．54 × 106-2．84 × 104X(R=0.9997)，Y = 6．75 × 105-7．73 × 103X(R=0.9998)，Y =8．31 × 104+5．22 × 103X(R=0.9998)，Y = 7．19 × 105-4．38 × 103X(R=0.9996)。苦杏仁苷的线性范围为0.05～0.44 μg，PTMT的线性范围为0.043～0.51 μg，野樱花苷的线性范围为0.05～0.54 μg，苯甲醛的线性范围为0.06～0.48 μg，杏仁腈的线性范围为0.05～0.52 μg。从各回归方程的R值可以看出，各化合物在此HPLC条件下线性回归良好，满足要求。

2.3 不同温度条件下稳定性

结果表明，温度低于40℃时，苦杏仁苷、PTMT、野樱花苷、苯甲醛和杏仁腈12 h后的峰面积RSD值均分别为0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、0.9%。当在50℃保温时，苦杏仁苷在6 h时的RSD值为4.5%，杏仁腈的RSD值为3.7%，这表明苦杏仁苷和杏仁腈在此温度下不稳定。50℃保温12 h时PTMT、野樱花苷、苯甲醛的RSD值分别为1.2%、1.3%和1.1%，这说明PTMT、野樱花苷、苯甲醛在50℃时稳定。因此，同时测试苦杏仁苷及其酶解产物的温度不应超过30℃。

2.4 不同pH条件下的稳定性

实验结果表明，当pH值为5.0时，苦杏仁苷和杏仁腈在溶液中不稳定，4 h时峰面积的RSD值分别为8.7%和7.4%。当pH为6.0时，各成分在溶液中稳定，12 h时苦杏仁苷、PTMT、野樱花苷、苯甲醛和杏仁腈峰面积的RSD值分别为1.1%、1.2%、1.4% 、0.93% 、1.3% 。

2.5 精密度和准确度

表1为日间和日内的精密度和准确度测试结果，从表中可以看出，所有样品的日内RSD值低于5.3%，日间RSD值低于4.9，日内的RE值介于0.3～3.3%，日间的RE值介于0.7～4.1%。以上结果表明，该HPLC方法具有较好的精密度和准确度。

表1 日间和日内的精密度和准确度n=6Table 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy(n=6)(mg/mL)

2.6 回收率结果

回收率分析结果表明，苦杏仁苷、PTMT、野樱花苷、苯甲醛和杏仁腈的回收率分别为99%、100.4%、98%、99%、99%。这表明，所采用HPLC方法回收率符合要求。

3 结论

对苦杏仁苷的研究主要集中在苦杏仁苷的脱毒、加工、分析、检测等方面［11，12］，尚没有关于对苦杏仁苷及其酶解产物的分析检测的研究报道。本文建立了一个高效、快速的同时检测苦杏仁苷及其4个酶解产物的HPLC方法，应用该方法，可以在23 min内完成一次检测分析。该HPLC分析方法稳定、可靠，精密度和准确度符合要求，结果能很好的重现，柱温25℃，pH 6.0～7.0。

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