固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定海水中13种三嗪类除草剂残留量

任传博，田秀慧，张华威，刘 云，孙 岩，徐英江，宫向红，王茂剑

(1.山东省海洋水产研究所, 山东 烟台 264006; 2.烟台山水海产有限公司, 山东 烟台 264006;3.山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006;4.上海海洋大学食品学院, 上海 201306)

固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定海水中13种三嗪类除草剂残留量

任传博1,2，田秀慧1,3，张华威1,2，刘 云4，孙 岩1,3，徐英江1,3，宫向红1,3，王茂剑1，3

(1.山东省海洋水产研究所, 山东 烟台 264006; 2.烟台山水海产有限公司, 山东 烟台 264006;3.山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006;4.上海海洋大学食品学院, 上海 201306)

建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定海水中13种三嗪类除草剂，样品抽滤后，经HLB固相萃取柱浓缩净化，洗脱液40 ℃下氮气吹至小于1 mL，然后用V(乙腈)∶V(水)=1∶1的溶液定容至1 mL，超声振荡1 min，样液经0.22 μm滤膜，在AcquityTMUPLC HSS C18(2.1 mm ×100 mm×1.8 μm)色谱柱上进行梯度洗脱分离。流动相为乙腈和含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液，多反应监测模式下测定13种三嗪类除草剂残留量。13种三嗪类除草剂的线性范围为1～50 ng/L，相关系数为0.992～0.999；检出限为1 ng/L，定量限为2 ng/L，在2、5、10 ng/L 3个浓度水平加标平均回收率为65.8%～103%，相对标准偏差RSD为4.84%～15.2%。该方法灵敏度高、准确性好，适用于海水中除草剂类药物的检测。

三嗪类；海水；超高效液相色谱-串联质谱；固相萃取

三嗪类除草剂是现代除草剂中最重要的类型之一，约占所有农用除草剂的30%。三嗪类除草剂在农田中大量使用，会危害生态环境和人类健康，造成巨大损失[1]。在这类除草剂中，西玛津已被美国环保署列入内分泌干扰物名单；嗪草酮也已被确认是一种内分泌干扰物质；阿特拉津可使哺乳动物乳腺癌发病率增大，也可能引起人体垂体功能紊乱[2-4]。各种除草剂残留最终随着径流排入大海，对海洋环境造成污染，同时影响人们的生产和生活。随着除草剂对人类健康和环境的毒害被人们所关注，其限量指标更为严格。欧盟正式禁止使用扑草净、环嗪酮、莠灭净、氰草津等三嗪类除草剂；阿特拉津和西玛津被美国环保署列为优先控制污染物名单；法国从2002年9月起禁止销售阿特拉津和西玛津，并从2003年6月起禁止使用。我国只对饮用水中三嗪类除草剂做出标准，如阿特拉津的限值为3 μg/L[5]，目前尚未制定海水中三嗪类除草剂的残留限量和标准分析方法，因此建立海水中三嗪类除草剂多残留快速、可靠的分析方法具有重要的实际意义。

三嗪类除草剂常用的检测方法主要有气相色谱法(GC)[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]、气相色谱-质谱法(GC/MS)[8]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[9]等，其中GC和HPLC仅以保留时间定性，易出现假阳性结果；GC/MS和HPLC-MS/MS检出限较低、定性更准确，符合痕量检测的发展趋势。测定样品一般为土壤[10]、谷物[11-12]、豆类[7]、蔬菜和水果[13]等。样品中常用的净化方法有凝胶渗透色谱法[14]、液液萃取法[15]和固相萃取法[16-17]等，其中固相萃取法已成为检测水体中痕量除草剂残留最重要的预处理技术，所检测除草剂类型主要有磺酰脲类[18]、苯氧羧酸类[19]、二苯醚类和吡啶类[20-21]等。本研究采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定海水中13种三嗪类除草剂残留，并用于海水样品检测，旨在满足海水样品中农药残留分析的要求。

1实验部分

1.1仪器与试剂

Quattro Premier XE超高效液相色谱-串联质谱仪：美国Waters公司产品；Milli-Q Gradient超纯水仪：法国Millipore公司产品；TGL-10C高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；KQ-600E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；N-EVAPTM112氮吹仪：美国Organomation Associates公司产品；ASPEC XL4+全自动固相萃取仪：法国Gilson公司产品； HLB 固相萃取小柱(60 mg/3 mL)：美国Waters公司产品。

甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸为优级纯；13种三嗪类除草剂(阿特拉津、扑草净、环嗪酮、扑灭津、敌草净、嗪草酮、苯嗪草酮、草净津、西玛津、仲丁通、莠灭净、特丁津和特丁净)标准品：纯度均不小于98%，结构式示于图1；混合标准溶液：称取适量三嗪类除草剂标准品，用甲醇溶解，配成100 mg/L 标准储备溶液，使用前用流动相稀释至所需质量浓度。

图1 13种三嗪类除草剂的结构式 Fig.1 Structures of 13 kinds of triazine herbicides

1.2样品提取与净化

准确量取1 L海水样品，经抽滤装置抽滤后，加入40 mL甲醇，用全自动固相萃取仪过活化后的HLB小柱(3 mL甲醇、3 mL水活化)进行富集，然后用3 mL超纯水淋洗，9 mL甲醇洗脱，于40 ℃下氮气吹干，用V(乙腈)∶V(水)=1∶1的溶液定容至1 mL，超高效液相色谱-串联质谱法测定。

1.3色谱条件

色谱柱：AcquityTMUPLC HSS C18 (2.1 mm×100 mm×1.8 μm)；色谱柱温度：40 ℃；流动相：乙腈(A)和含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液(B)；流速：0.25 mL/min；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序列于表1。

1.4质谱条件

配制13种三嗪类除草剂自动调谐液(均为1 mg/L)，采用蠕动泵进样方式(10 μL/min)，自动调谐。电离方式：正离子(ESI+)；电离电压：2.50 kV；锥孔电压：30 V；离子源温度：110 ℃；锥孔反吹气流速：50 L/h；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流速：700 L/h；氩气流速：0.14 mL/min；其他优化的质谱参数列于表2。

表1 13种三嗪类除草剂液相梯度洗脱程序

表2 13种三嗪类除草剂UPLC-ESI-MS/MS仪器参数

注：*代表定量离子

2结果与讨论

2.1监测离子对的选取

根据图1所示的13种三嗪类除草剂的结构式，可知此类化合物均为含氮的碱性化合物，因此采用正离子扫描模式，这类化合物容易加和氢离子形成正电荷母离子[M+1]，然后将母离子打碎，优化碰撞能量，将响应最高的两个子离子作为特征性子离子。以阿特拉津为例，其易形成m/z216.1的[M+1]正离子，碰撞后响应最高的子离子为m/z174.1和96.1，示于图2。

2.2提取条件的确定

本研究对比了乙酸乙酯提取法、固相萃取法和二氯甲烷提取法，在上述3种提取条件下，三嗪类除草剂平均回收率列于表3。由表中可以看出，对13种待测物来说，二氯甲烷提取法回收率均小于50%，乙酸乙酯提取法和固相萃取法要优于二氯甲烷提取法，且2种提取法的差异不显著。由于乙酸乙酯与海水有一定的混溶性，且乙酸乙酯提取法试剂用量大、操作比较繁琐，因此本研究采用固相萃取法。

图2 阿特拉津母离子(a)和子离子(b)扫描图Fig.2 Ions chromatograms of parention (a) and daughterion (b) for atrazine

化合物名称乙酸乙酯提取法/%固相萃取法/%二氯甲烷提取法/%阿特拉津88.282.525.6扑草净89.075.630.4环嗪酮75.369.845.6扑灭津78.566.433.6敌草净68.865.425.6嗪草酮70.172.545.9苯嗪草酮71.569.122.2草净津75.672.627.5西玛津78.470.759.9特丁津68.575.440.6仲丁通67.178.436.2莠灭净79.277.337.7特丁净69.166.933.2

2.3流动相的确定

本研究的有机相分别实验了甲醇和乙腈，水相实验了纯水、0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵和含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，发现采用乙腈和含有0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液时，分离效果和响应值达到最佳。

2.4标准曲线

分别配制一系列标准工作溶液1.0、2.5、5.0、10.0和50.0 μg/L，在优化色谱和质谱条件下进行测定，标准溶液(10 μg/L)色谱图示于图3，13种三嗪类除草剂药物的线性方程、线性范围和相关系数列于表4。

2.5检测限、回收率及相对标准偏差

采用超纯水作为样品空白和基质添加，添加浓度分别为2、5和10 ng/L，回收率及相对标准偏差列于表5。

图3 13种三嗪类除草剂(10 μg/L)选择离子流图Fig.3 Selected ions chromatogram of 13 kinds of triazine herbicides(10 μg/L) in MRM mode

化合物名称线性方程线性范围/(ng/L)相关系数阿特拉津y=120.741x+369.2961～500.996扑草净y=921.181x+2799.241～500.996环嗪酮y=756.882x-1702.251～500.992扑灭津y=435.09x+255.111～500.998敌草净y=2244.9x-244.1841～500.998嗪草酮y=18.5236x-33.85291～500.997苯嗪草酮y=103.023x+246.181～500.993草净津y=129.17x+32.87991～500.999西玛津y=64.438x+24.90421～500.998特丁津y=1082.77x+1488.81～500.997仲丁通y=6641.93x+7404.641～500.995莠灭净y=1971.74x+3342.581～500.999特丁净y=2276.2x+5630.791～500.998

表5 13种三嗪类除草剂类药物的回收率及相对标准偏差(n=3)

图4 海水样品色谱图(阿特拉津(a)、扑草净(b)和莠灭净(c))Fig.4 Seawater sample chromatogram(atrazine(a), prometryn(b) and ametryn(c))

2.6海水样品结果分析

通过实验发现，海水中阿特拉津、扑草净、莠灭净污染情况较多，实际样品谱图示于图4，其中阿特拉津含量为2.63 ng/L，扑草净含量为4.75 ng/L，莠灭净含量为1.88 ng/L。

本研究对渤海某海域60个站位的海水样品进行采样分析，阿特拉津、扑草净、莠灭净的检出率为100%，取其中10个站位的测定结果列于表6。

表6 13种三嗪类除草剂类药物实际样品测定结果(ng/L)

3结论

本研究发现13种三嗪类除草剂在海水中并无离子抑制或增强现象，因此采用超纯水作为样品空白和样品添加基质。建立了海水中13种三嗪类除草剂的超高效液相色谱-串联质谱法。样品经SPE柱净化浓缩，AcquityTMUPLC HSS C18色谱柱分离，然后进行MS/MS多反应监测模式下的定性及定量分析，外标法定量。方法检出限为1 ng/L，在2、5和10 ng/L 3个浓度水平加标平均回收率为65.8%～103%，相对标准偏差在16%以内。该方法灵敏度高、操作简单高效，适用于海水中13种三嗪类除草剂的定量及确证分析。

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DeterminationofTriazineHerbicidesinSeawaterUsingSolidPhaseExtraction-UPLC-MS/MS

REN Chuan-bo1,2, TIAN Xiu-hui1,3, ZHANG Hua-wei1,2, LIU Yun4, SUN Yan1,3, XU Ying-jiang1,3, GONG Xiang-hong1,3, WANG Mao-jian3

(1.MarineFisheriesResearchInstituteofShandongProvince,Yantai264006,China;2.YantaiShanshuiSeafoodCo.Ltd,Yantai264006,China;3.ShandongProvinceKeyLaboratoryofRestorationforMarineEcology,Yantai264006,China;4.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

The triazine herbicides in seawater were determined by solid phase extraction ultra performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS). UPLC and MS/MS analytical conditions were examined and optimized critically by a series of experiments. Samples were filtrated and purified on the HLB solid phase extraction cartridges. The elution was collected and evaporated to less than 1 mL at 40 ℃ by nitrogen blow, then added to 1 mL acetonitrile and water (1∶1，V/V) and ultrasonic wave extraction for 1 min. After filtrated with 0.22 μm filter membrane, the residue was separated by AcquityTMUPLC HSS C18 column (2.1 mm×100 mm×1.8 μm) using gradient elution separation. The mobile phase was a mixture of A (acetonitrile) and B (5 mmol/L ammonium acetate containing 0.1% formic acid) in a flow rate of 0.25 mL/min. Finally analytes were confirmed and quantified using MS/MS system in multiple reaction mode with triple quadrapole analyzer using positive polarity mode. The analytes show good linearity in the range of 1 ng/L to 50 ng/L with correlation coefficient from 0.992 to 0.999. The detection limit is 1 ng/L， and quantification limit is 2 ng/L. The average recoveries at three dose levels(2 ng/L, 5 ng/L and 10 ng/L) are 65.8%—103% with relative standard deviations from 4.84% to 15.2%. In addition, the method has merits of simplicity, sensitivity and rapidity, and can be used for simultaneous determination of triazine herbicides in seawater.

triazine; seawater; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; solid phase extraction

O 657.63

A

1004-2997(2013)06-0353-09

10.7538/zpxb.youxian.2013.34.0001

2013-02-04；

2013-05-20

山东省现代农业产业技术体系刺参产业创新团队项目；烟台市科技发展计划项目(2012134)；山东省科学技术发展计划项目(2012GHY11517)；山东省“水生动物营养与饲料”泰山学者岗位项目(2007-2012) 资助

任传博(1982～)，男(汉族)，山东济南人，助理工程师，从事食品质量与安全研究。E-mail：ren0478@sina.com

王茂剑(1964～)男，研究员，从事食品科学与工程研究。E-mail：wangmaojian@126.com

时间：2013-9-16；

：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20130916.1522.001.html