薄层色谱法鉴别双黄连口服液中金银花成分的改进

北京市朝阳区药品检验所（100028）肖宏华 甄诚 刘开玉

双黄连口服液具有疏风解表，清热解毒的功效[1]，是常用中成药。处方中金银花成分是其清热解毒、疏散风热的关键成分。金银花与山银花来源不同，所含成分也有较大区别，使用中不能相互替代。《中国药典》2010年版利用薄层色谱法仅对其所含金银花成分中绿原酸进行鉴别。本研究在参考相关文献[2][3][4][5][6][7]的基础上，建立新的薄层色谱方法，增加对金银花成分中所含木犀草苷进行鉴别，并利用山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙特征成分[1]对其是否含有山银花进行鉴别。优选了样品处理方法和薄层色谱展开条件，比较了不同的显色剂，实验结果表明该方法可鉴别出双黄连口服液中木犀草苷成分以及是否使用了山银花，方法简便、专属性强，为双黄连口服液中金银花成分的鉴别提供了依据和参考。

1 仪器与试药

Linomat5半自动点样仪、Digistore2数码成像系统（瑞士Camag）；LD5-2A型离心机（北京医用离心机厂）。甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇、甲酸、丙酮、95%乙醇、浓盐酸、浓硫酸、三氯化铝（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水（Limit RO-40-H系统制备）；高效硅胶G60薄层板（德国Merck）；金银花对照药材（121060-201107）、山银花（灰毡毛忍冬）对照药材（121595-201001）、木犀草苷对照品（11720-201106）、绿原酸对照品（110753-200413）、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（111814-201102）、川续断皂苷乙对照品（111813-201202）均来源于中国食品药品检定研究院；4批双黄连口服液为不同厂家生产的市售药品（见附表）。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品，加70%乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液。另取绿原酸对照品、灰毡毛忍冬皂苷乙对照品、川续断皂苷乙对照品，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液。

2.2 对照药材溶液的制备

2.2.1 取金银花对照药材1g，加甲醇10ml超声处理20min，滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水10ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，水液备用，取乙酸乙酯液蒸干，残渣加70%乙醇2ml使溶解，作为金银花对照药材溶液①。

2.2.2 取2.2.1中备用水液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为金银花对照药材溶液②。

2.2.3 取山银花（灰毡毛忍冬）对照药材1g，按照2.2.1和2.2.2中方法制成山银花对照药材溶液①和山银花对照药材溶液②。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 取双黄连口服液10ml，加浓盐酸0.5ml，混匀，离心（3000rpm，10min），取上清液用氨试液调节pH值至6～7，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15ml，水液备用，取乙酸乙酯液蒸干，残渣加70%乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液①。

2.3.2 取2.3.1中备用水液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液②。

2.4 阴性对照溶液的制备 取黄芩和连翘药材按《中国药典》2010年版一部双黄连口服液项下的处方及制法，制成阴性样品溶液。取10ml按上述2.3.1项下方法自“加浓盐酸0.5ml”起制成阴性对照溶液①，按上述2.3.2项下方法制成阴性对照溶液②。

2.5 薄层色谱条件

2.5.1 木犀草苷、绿原酸 取木犀草苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、金银花对照药材溶液①、山银花对照药材溶液①、供试品溶液①、阴性对照溶液①各5μl，使用Linomat5半自动点样仪，以条带状方式（条带宽8mm）点样于同一硅胶G60高效薄层板（用甲醇预展开，室温下挥干，在105℃活化30min）上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以1%三氯化铝乙醇溶液，挥干，紫外光灯（365nm）下检视，并用Digistore2数码成像系统采集数码图像。

附表 样品信息

2.5.2 灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙 取灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品溶液、山银花对照药材溶液①各5μl，再取金银花对照药材溶液②、供试品溶液②、阴性对照溶液②各10μl，使用Linomat5半自动点样仪，以条带状方式（条带宽8mm）点样于同一硅胶G60高效薄层板（用甲醇预展开，室温下挥干，在105℃活化30min）上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视并用Digistore2数码成像系统采集数码图像。

3 结果

3.1 木犀草苷、绿原酸 按2.5.1条件展开得高效薄层色谱图（略）。通过对图谱中条斑的比较分析，金银花对照药材与4份供试品色谱中分别在Rf值0.56和Rf值0.63的位置上可检出与绿原酸和木犀草苷对照品相对应的荧光条斑，但在木犀草苷位置的条斑颜色深浅不一，尤其在供试品2色谱中颜色很浅，反映出不同厂家之间其含量的多少有所区别。山银花（灰毡毛忍冬）对照药材在Rf值0.56和Rf值0.63的位置上也可检出绿原酸和木犀草苷，但在相同提取条件下，山银花（灰毡毛忍冬）中木犀草苷条斑的颜色明显浅于金银花。阴性对照色谱中相应位置均未检出绿原酸和木犀草苷，表明阴性对照无干扰。该法可鉴别出供试品中除含有绿原酸外，还含有木犀草苷，不能区分使用的是金银花还是山银花（灰毡毛忍冬），但可区分是否为忍冬科植物的茎叶投料，茎叶中可检出绿原酸，但不能检出木犀草苷成分。

3.2 灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙 按2.5.2条件展开得高效薄层色谱图（略）。通过对图谱中条斑的比较分析，4份供试品色谱中分别在Rf值0.34与Rf值0.52的位置上均未检出与灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品颜色相对应的条斑。山银花（灰毡毛忍冬）色谱中可检出与上述两种对照品一致的条斑，金银花对照药材及阴性对照色谱中相应位置均未检出与上述两种对照品相同的条斑，表明4批供试品中均未使用山银花（灰毡毛忍冬），且阴性对照无干扰。该法可区分供试品中是否使用山银花（灰毡毛忍冬），如有疑似条斑可进一步置紫外光灯（365nm）下检视，上述二种对照品及山银花主要条斑显橙色荧光。

4 讨论

4.1 该薄层色谱法可简便、高效对双黄连口服液中金银花成分及是否使用山银花（灰毡毛忍冬）进行鉴别，供试品中除应检出绿原酸外，还应检出木犀草苷，不应检出灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷，如因对照品价格昂贵也可只用金银花和山银花对照药材进行鉴别。本文中使用的山银花为灰毡毛忍冬，另外的红腺忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬有待进一步研究。

4.2 供试品处理方法的比较：考察了①供试品适量浓缩至干，加甲醇适量溶解；②供试品用正丁醇萃取，浓缩；③供试品用乙酸乙酯和正丁醇分别振摇提取，浓缩。观察上述3种提取方法所得的薄层色谱图，前2种提取方法杂质较多，背景有干扰，相邻条斑分离不清晰。第3种提取方法，所得薄层色谱图效果最好，且加入适量浓盐酸并离心可有效去除较多的杂质。

4.3 展开系统：比较了4个展开系统，A：三氯甲烷-甲醇-水（6∶4∶1）；B：乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1）；C：乙酸丁酯-甲酸-水（7∶4∶3）上层溶液；D：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）。C和D展开系统均不能将对照品、对照药材及样品很好地分离，A和B展开系统可分别用于两类对照和样品的展开，展开后条斑之间分离清晰，且信息量较丰富。

4.4 显色剂的比较：木犀草苷为木犀草素-葡萄糖苷，用常用皂苷类显色剂如10%硫酸乙醇溶液显色，条斑显色不清晰，日光下仅显淡黄色；而直接在紫外光灯（365nm）下也仅显示暗棕色斑点，效果不明显；用1%三氯化铝乙醇显色后，在紫外光灯（365nm）下显示清晰亮黄色斑点，相邻条斑也可清楚识别，对绿原酸成分几乎无影响。灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙选择10%硫酸乙醇溶液为显色剂，显色明显，分辨清晰，而且可进一步在紫外光灯（365nm）下检视。

4.5 不同厂家的供试品在与木犀草苷相对应位置上所显的条斑颜色深浅不一，有必要建立高效液相色谱法进一步对其所含的木犀草苷含量进行研究。