先天性高胰岛素血症四例ABCC8基因突变分析

桑艳梅 张亚楠 刘敏 闫洁

·短篇论著·

先天性高胰岛素血症四例ABCC8基因突变分析

桑艳梅 张亚楠 刘敏 闫洁

先天性高胰岛素血症(congenital hyperinsulinism, CHI)是婴儿持续性、复发性低血糖的主要原因之一，迄今已发现了8种遗传学类型。ATP敏感性钾通道型先天性高胰岛素血症(KATP-CHI)是CHI最严重和最常见的类型，约占CHI患儿的40%～45%，其中82%的患儿对二氮嗪治疗无效[1-2]。ATP 结合暗盒蛋白家族C8(ATP-binding cassette subfamily C 8, ABCC8)基因编码的磺脲受体1(SUR1)是CHI最主要的致病基因，迄今已发现了150多种突变[3]。其遗传方式多为常染色体隐性遗传，少数为常染色体显性遗传，偶见新生突变。国外研究资料显示不同类型的ABCC8基因突变临床表现有着较大的异质性。本研究运用分子生物学技术对4例CHI患儿家系的ABCC8基因的39个外显子区进行测序，以期揭示CHI的致病机制。

一、材料与方法

1．一般资料：4例临床诊断为CHI患儿的一般情况见表1。2例患儿为足月适于胎龄儿，2例患儿为巨大儿。4例患儿母亲在孕期均体健，均无糖耐量异常病史，均无低血糖及糖尿病家族史。胰腺影像学检查均未见异常。

表1 4例CHI患儿临床资料及二氮嗪治疗的疗效

2．治疗经过：3例患儿确诊后曾予以二氮嗪为期7～10 d的试验性治疗，当二氮嗪增加至15 mg·kg-1·d-1时3例患儿仍表现频繁发作的低血糖，提示该3例患儿对二氮嗪治疗无效，故予以停用。其中病例1经知情同意后转入外科进行了胰腺次全切除术治疗，术后血糖恢复至正常水平，经长期随访，胰腺内、外分泌功能正常。病例2和3继续予以多餐喂养、喂食葡萄糖等内科非手术治疗。病例4应用奥曲肽治疗1个多月，患儿血糖控制良好，但因奥曲肽价格昂贵，予以停用，改用多餐喂养及喂食葡萄糖等内科治疗。

3．遗传学分析：分别留取4例CHI患儿家系的外周血，用promega公司基因组提取试剂盒提取基因组DNA。利用primer premier 5.0软件设计用于扩增ABCC8基因39个外显子区的相应引物。PCR反应体积： 5×GoTaq缓冲液10 μl，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各1 μmol/L，1.25 U热启动Taq酶(Promega公司)，总体积50 μl。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s、62～64℃(ABCC8及KCNJ11基因)或58～62℃(GLUD1基因)30 s、72℃ 45 s，循环38次，最后72℃延长5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收(Tiangen公司凝胶回收试剂盒)，纯化，送北京英俊公司(Invitrogen)测序。本项研究获得医院伦理委员会的批准，并于抽血前获得患儿父母的知情同意。

二、结果

病例3患儿及其母亲ABCC8基因的第29外显子区发现了一个c.3650 G>A杂合突变，患儿父亲该位点基因型正常(G/G)，该突变的遗传方式为母系常染色体显性遗传。该突变导致编码产物第1217位氨基酸性质由精氨酸(R)变为赖氨酸(K，图1)。该突变既往文献未见报道。

图1 病例3 ABCC8基因测序图

病例4患儿及其父亲ABCC8基因的第37外显子区发现了一个c.4487 G>A杂合突变，患儿母亲该位点的基因型正常，该突变的遗传方式为父系遗传。该突变导致编码产物第1493位氨基酸残基由精氨酸(R)突变为谷氨酰(Q，图2)。该突变曾有文献报道。

图2 病例4 ABCC8测序图

讨论ABCC8基因突变是第一个被发现与CHI有关的基因，也是CHI最常见的致病基因。ABCC8基因由39个外显子组成，长度超过100 kb，编码1582个氨基酸，核酸重约177 000。位于染色体11p15.1。

本研究4例CHI患儿中1例为ABCC8基因第29外显子区G>A杂合突变，为母系常染色体显性遗传，既往文献未见报道,提示其为罕见的ABCC8突变类型。常染色体显性遗传基因突变所致的KATP-CHI临床上相对少见，其遗传方式包括父系遗传及母系遗传[4]。近期研究发现，由母系遗传的ABCC8突变所致的CHI患儿临床症状较轻，由于二氮嗪可结合正常的SUR1亚单位形成杂聚钛复合体或有足够的正常钾离子通道，所以该类患儿多对药物治疗有效，经不同时间的治疗后患儿的低血糖症状多可缓解或消失，从而避免了胰腺切除术所引起的一系列不良反应及并发症的发生[5]。

本研究中1例为ABCC8基因第37外显子区G>A杂合突变，为父系常染色体显性遗传，既往文献已有报道。国外研究资料显示：父系遗传的ABCC8基因突变包括了下列两种可能性：(1)父系遗传的常染色体显性遗传基因突变，即父亲和患儿均携带同样的突变，患儿母亲突变位点的基因型正常。该类突变CHI的组织学类型为弥散型。患儿临床症状轻重不一，起病年龄偏早，且多对二氮嗪等药物治疗无效，需行不同程度的胰腺切除术来控制低血糖的发生[6]。(2)常染色体隐性遗传基因突变的特殊类型，即体细胞父系ABCC8突变伴胰腺病灶内母系染色体片段(11p15)缺失，该丢失的染色体区域内含有β细胞钾通道ABCC8和KCNJ11基因和印记的肿瘤抑制基因。这种特殊的基因组合造成受影响的β细胞中突变基因半合子数目减少和细胞生长的不平衡，最终导致局灶型KATP-CHI[7]。该型患儿多存在钾通道构成的异常，病情较重，多于新生儿期发病，出生体重多为巨大儿，患儿于出生后几天内即表现出严重而持续性的低血糖症，需要大量的葡萄糖维持血糖的正常，还常伴有低血糖引起的抽搐、惊厥、肌张力低下、喂养困难、呼吸暂停等；多对二氮嗪等药物治疗无效、需行不同程度的胰腺切除术来控制低血糖的发生[8]。本研究中1例于生后4个月起病，出生体重正常，对二氮嗪治疗无效，提示其为常染色体显性遗传基因突变所致的KATP-CHI可能性大。按照国外经验，对此类患儿应进一步行18F-L-Dopa PET SCAN 等影像学检查协助组织学分型，以制订下一步的治疗方案。但目前国内尚未开展此项技术，使该类患儿的组织学分型及外科手术方式的选择等方面均面临一定的困难[9]。

奥曲肽是一种人工合成的生长抑素类似物，是胰岛素释放的强效抑制剂，可从多因素调控胰腺β细胞的功能，在国外经常应用于对二氮嗪治疗无效的CHI患儿[10]。本研究中病例4应用奥曲肽试验性治疗，结果患儿对奥曲肽治疗有效，患儿血糖控制良好，无明显不良反应。上述结果提示，携带ABCC8 R1493Q突变的患儿对奥曲肽治疗有效，可长期应用该类药物进行内科治疗，从而防止低血糖的发生。但奥曲肽需要皮下给药、价格昂贵，其在国内二氮嗪治疗无效患儿中的应用受到一定限制。

ABCC8基因突变根据功能的不同可分为两种类型：Ⅰ型突变(classⅠ)，它通过蛋白的完全丢失或交通缺陷导致细胞表面钾通道表达的减少；Ⅱ型突变(classⅡ)，它破坏了MgADP刺激钾通道活化的能力，因此阻止了钾通道被代谢抑制所诱导的活化，该类突变患儿的钾通道蛋白正常存在，KATP通道却处于关闭状态。其中以I型突变导致的临床表型更为严重。某些Ⅱ型突变由于钾通道对MgADP有部分反应,临床症状可表现较轻。本研究病例3携带的R1217K突变位于ABCC8基因的第29外显子区，病例4携带的R1493Q突变位于ABCC8基因的第37外显子区，其具体突变类型及致病机制尚不明确，有待进一步的功能表达研究来证实。

总之，作为CHI的主要类型KATP-CHI有着复杂的致病机制，不同的ABCC8突变类型所致的CHI临床表型存在一定的异质性。随着研究的不断深入，将有更多的钾通道致病基因被发现，这对于KATP-CHI遗传发病机制的阐明及治疗策略的制订有着重要的理论意义。

[1] Arnoux JB，de Lonlay P， Ribeiro MJ，et al. Congenital hyperinsulinism. Early Hum Dev, 2010,86：287-294.

[2] Saint-Martin C, Arnoux JB, de Lonlay P, et al.KATP channel mutations in congenital hyperinsulinism.Semin Pediatr Surg, 2011，20:18-22.

[3] James C, Kapoor RR, Ismail D, et al.The genetic basis of congenital hyperinsulinism.J Med Genet, 2009，46:289-299.

[4] Pinney SE, MacMullen C,Becker S,et al. Clinical characteristics and biochemical mechanisms of congenital hyperinsulinism associated with dominant KATP channel mutations.J Clin Invest, 2008, 118:2877-2886.

[5] Arnoux JB, Verkarre V, Saint-Martin C, et al. Congenital hyperinsulinism: current trends in diagnosis and therapy.Orphanet J Rare Dis. 2011,6:63.

[6] Pinney SE, MacMullen C, Becker S, et al.Clinical characteristics and biochemical mechanisms of congenital hyperinsulinism associated with dominant KATP channel mutations. J Clin Invest, 2008,118: 2877-2886.

[7] Bellanné-Chantelot C, Saint-Martin C, Ribeiro MJ, et al.ABCC8 and KCNJ11 molecular spectrum of 109 patients with diazoxide-unresponsive congenital hyperinsulinism.J Med Genet, 2010,47:752-759.

[8] Henwood MJ, Kelly A, Macmullen C, et al.Genotype-phenotype correlations in children with congenital hyperinsulinism due to recessive mutations of the adenosine triphosphate-sensitive potassium channel genes. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90:789-794.

[9] Barthlen W, Blankenstein O, Mau H, et al. Evaluation of (18F) fluoro-L-DOPA position emission tomography-computed tomography for surgery in focal congenital hyperinsulinism. J Clin Endocrinol Metab,2008, 93:869-875.

[10] De Leon DD, Stanley CA.Mechanism of disease: Advances in diagnos is and treatment of hyperinsulinism in neonates.Nat Clin Pract Endocrinol Metab,2007,3: 57- 68.

2013-04-03)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.015

北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划(2011-3-051)；首医基础-临床合作项目(jl58)

100045 北京，首都医科大学附属北京儿童医院内分泌遗传代谢中心,儿科学国家重点学科

桑艳梅，Email:sangyanmei@yahoo.com