艾塞那肽诱发大鼠胰腺组织病变的实验研究

杨永超 余枭 黄利华 余灿

·论著·

艾塞那肽诱发大鼠胰腺组织病变的实验研究

杨永超 余枭 黄利华 余灿

目的探讨艾塞那肽诱发大鼠胰腺组织病变的可能机制。方法SD雄性大鼠30只按完全随机法分为艾塞那肽组、糖尿病组和对照组，每组10只。高糖、高脂喂养及腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg体质量)方法诱导大鼠糖尿病模型，艾塞那肽组和糖尿病组每天2次皮下注射艾塞那肽5 μg/kg体质量，对照组皮下注射等容积生理盐水，实验周期为10周。大鼠处死后取胰腺组织，常规病理检查。免疫组化法检测胰腺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅲ型胶原蛋白表达，ELISA 法检测胰腺组织基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9含量。结果对照组大鼠胰腺组织未见病理变化，艾塞那肽组大鼠胰腺组织出现慢性炎性改变，糖尿病组大鼠胰腺病变程度较艾塞那肽组严重，3组胰腺病理评分依次增高(P<0.05)。对照组、艾塞那肽组和糖尿病组胰腺组织的MMP-2含量分别为(186.98±23.24)、(306.07±59.82)、(365.08±89.55)μg/L；MMP-9含量分别为(49.37±7.08)、(67.24±14.73)、(87.37±13.39)μg/L。艾塞那肽组和糖尿病组均显著高于对照组(P值均<0.05)，但艾塞那肽组和糖尿病组间的差异无统计学意义。对照组、艾塞那肽组和糖尿病组大鼠高倍视野内胰腺组织的α-SMA阳性表达细胞数分别为(13.4±6.0)、(29.5±8.8)、(79.3±27.2)个，Ⅲ型胶原蛋白阳性表达细胞数分别为(10.6±4.9)、(29.3±13.0)、(56.0±27.2)个。艾塞那肽组阳性细胞数均显著多于对照组，糖尿病组阳性细胞数又显著多于艾塞那肽组(P值均<0.05)。结论长期皮下注射艾塞那肽可能激活胰腺星状细胞，表达α-SMA和Ⅲ型胶原蛋白，分泌MMP-2、MMP-9，诱发胰腺组织慢性炎性改变。

胰腺； 星形细胞； 艾塞那肽； 病理学； 大鼠

艾塞那肽是第一个应用于临床治疗糖尿病的肠促胰岛素激动剂。2008年Ahmad等[1]发表了艾塞那肽致急性胰腺炎(AP)的报道后，关于使用艾塞那肽后出现胰腺炎的报告不断增加[2-5]，表明艾塞那肽有诱发胰腺炎的可能。但也有文献报道艾塞那肽并不诱发胰腺炎，反而可减轻化学诱导的胰腺炎症损害[6]。本研究组前期的动物实验结果表明，长期应用艾塞那肽可导致部分SD大鼠胰腺组织出现慢性炎性改变[6]。本研究进一步探讨艾塞那肽诱发大鼠胰腺组织病变的可能机制。

材料与方法

一、实验动物分组

SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠30只，体质量280～310 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，同时提供饲料。按照完全随机设计的原则将大鼠分为艾塞那肽组、糖尿病组和对照组。高脂、高糖喂养2个月后采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)35 mg/kg体质量的方法制备糖尿病大鼠模型，72 h后连测3 d空腹血糖，空腹血糖均值>17.1 mmol/L为造模成功标准。艾塞那肽组和糖尿病组大鼠每天于早上7点及晚上5点皮下注射艾塞那肽(上海肽仕生物科技有限公司)5 μg/kg体质量，注射后1 h进食。每周称重一次，根据体质量调整艾塞那肽的用量。对照组大鼠仅皮下注射等容积生理盐水。实验周期为10周。第10周末，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，开胸，暴露心脏，经左心室依次灌注0.01 mol/L PBS缓冲液250～300 ml，4%多聚甲醛溶液300～450 ml，直到大鼠肝脏颜色变成深黄色。取部分胰腺组织，立即置4%多聚甲醛溶液中并于4℃冰箱固定24 h。

二、胰腺组织病理学检测

取固定的胰腺组织，常规行病理学检查。根据Zhang等[7]的胰腺病理评分标准并参照改良的Schmidt等[8]方法对胰腺损伤进行评分。

三、胰腺组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9蛋白检测

取部分新鲜的胰腺组织，在冰生理盐水中漂洗后称重，剪碎，加9倍量的匀浆介质(pH7.4，0.01 mol/L Tris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的氯化钠溶液)制成组织匀浆，离心，取上清液，采用酶联免疫试剂盒(R&D公司)检测MMP-2、MMP-9含量。

四、胰腺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅲ型胶原蛋白检测

采用免疫组化法检测组织α-SMA、Ⅲ型胶原蛋白表达，免疫组化试剂盒均由美国Santa公司提供，按试剂盒说明操作。在400倍镜下随机选取5个视野，以胞质内有棕黄色颗粒状染色为阳性，计算阳性细胞数，取均值。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠胰腺组织的病理改变

对照组大鼠胰腺组织未见病理改变。艾塞那肽组大鼠胰腺组织局部腺泡细胞水肿，腺泡间隔扩张，出现慢性炎性改变。糖尿病组大鼠胰腺腺泡细胞水肿，腺泡间隔扩张程度较艾塞那肽组严重(图1)。艾塞那肽组大鼠胰腺组织在水肿、纤维化、病变面积、炎症等方面的病理评分较对照组显著增加，糖尿病组大鼠胰腺组织的病理评分又较艾塞那肽组显著增加，差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。但各组间胰腺腺体萎缩的病理评分差异无统计学意义(表 1)。

表1 各组大鼠胰腺组织的病理评分

注：与对照组比较，t值均为71，aP<0.05；与艾塞那肽组比较，t值均为82，bP<0.05

二、大鼠胰腺组织MMP-2、MMP-9蛋白含量

对照组、艾塞那肽组和糖尿病组胰腺组织的MMP-2含量分别为(186.98±23.24)、(306.07±59.82)、(365.08±89.55)μg/L；MMP-9含量分别为(49.37±7.08)、(67.24±14.73)、(87.37±13.39)μg/L。艾塞那肽组和糖尿病组均显著高于对照组，差异具有统计学意义(t值分别为-6.872、-5.111、-3.821、-4.787，P值均<0.05)，但艾塞那肽组和糖尿病组间的差异无统计学意义。

三、大鼠胰腺组织α-SMA的表达

对照组大鼠胰腺内α-SMA表达仅见于血管壁；艾塞那肽组和糖尿病组大鼠胰腺α-SMA表达除见于血管壁外，还见于胰腺腺泡细胞的周围及间质，阳性染色细胞多，染色沉着，且糖尿病组的阳性染色区域较艾塞那肽组的范围更大(图1)。

对照组、艾塞那肽组和糖尿病组大鼠胰腺高倍视野下α-SMA阳性细胞数分别为(13.4±6.0)、(29.5±8.8)、(79.3±27.2)个，艾塞那肽组显著多于对照组，糖尿病组又显著多于艾塞那肽组，差异均具有统计学意义(t值分别为-2.003、-2.599，P值均<0.05)。

四、大鼠胰腺组织Ⅲ型胶原蛋白的表达

Ⅲ型胶原蛋白表达于胰腺组织的间质内(图2)。对照组、艾塞那肽组和糖尿病组大鼠胰腺高倍视野下Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞数分别为(10.6±4.9)、(29.3±13.0)、(56.0±27.2)个，艾塞那肽组显著多于对照组，糖尿病组又显著多于艾塞那肽组，差异均具有统计学意义(t值分别为-2.784、-2.883，P值均<0.05)。

图1对照组(上)、艾塞那肽组(中)、糖尿病组(下)胰腺组织(左)的病理改变(HE ×100) 及α-SMA表达(右，免疫组化 ×200)

图2对照组(a)、艾塞那肽组(b)、糖尿病组(c)胰腺组织Ⅲ型胶原蛋白的表达(免疫组化 ×200)

讨 论

艾塞那肽诱发大鼠胰腺组织损伤的机制可能有：(1)通过局部及中心迷走神经刺激胰腺的内外分泌功能，进而对胰腺产生广泛的损害，诱发胰腺炎[9]；(2)艾塞那肽为来自美洲巨蜥唾液中毒液的生物制品，与人体的免疫系统存在某种排斥反应，从而导致胰腺炎的发生[10]；(3)脂蛋白及胰腺内分泌功能改变所引起的体重减轻可能是其诱发胰腺炎的原因[11]；(4)应用艾塞那肽后导致GLP-1受体大量活化，引起胰腺体积增大，同时选择性调节胰腺炎相关性基因的表达，诱发胰腺炎[12]。但Tatarkiewicz等[6]研究却表明,艾塞那肽不诱发胰腺炎，反而可减轻化学诱导的胰腺炎，这可能与其实验动物种类、用药剂量及实验周期不同有关。

本研究结果显示，艾塞那肽组出现典型的慢性胰腺炎改变，其中2只大鼠的改变最为明显；糖尿病组也出现慢性胰腺炎表现，且病变程度较艾塞那肽组更重，其中4只病变最为明显。糖尿病组病变程度更重的原因可能有：(1)糖尿病的胰岛中存在胰腺星状细胞(PSC)，艾塞那肽可激活PSC引起更广泛、更严重的损害[13]；(2)在糖尿病长期的病理生理状态下，胰腺组织中的PSC可能对艾塞那肽敏感性增加，更容易被激活引起慢性炎性病变。

王兴鹏等[14]报道，α-SMA为PSC活化的标志物。PSC活化后可分泌细胞外基质(ECM)。Apte等[15]报道，活化的PSC能分泌大量MMP，参与细胞外基质的降解。本研究结果显示，艾塞那肽组和糖尿病组大鼠胰腺组织中α-SMA及Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞数量均较对照组增多，细胞染色程度深，且糖尿病组的阳性细胞数又较艾塞那肽组显著增加，同时胰腺组织中MMP-2、MMP-9含量显著增加，提示两实验组胰腺组织中PSC被大量激活，糖尿病组胰腺组织有更多的PSC被激活。

慢性胰腺炎是胰腺癌发病最常见的危险因素。Vakkila等[16]研究表明，慢性胰腺炎患者患胰腺癌风险较普通人群明显增加15～16倍，并且慢性胰腺炎发生癌变的风险随时间的推移而逐渐增加。由此推断，长期使用艾塞那肽可诱发慢性胰腺炎，将会增加胰腺癌风险。尽管艾塞那肽治疗2型糖尿病有诸多优点，但其增加胰腺癌风险的可能更不应该忽视。

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TheexperimentalstudyofpancreatictissuelesioninducedbyExenatide

YANGYong-chao,YUXiao,HUANGLi-hua,YUCan.

DepartmentofAbdominalSurgery,ThirdXiangyaHospital,Central-SouthUniversity,Changsha410013,China

ObjectiveTo explore the mechanism of Exenatide-induced rat pancreatic tissue lesion.MethodsThirty SD male rats were divided into three groups according to complete random design, and each group had 10 rats, namely Exenatide group, diabetes-model group and control group. Diabetes-model rats were induced by streptozotocin (STZ, 35mg/kg) and high-sugar and high-fat diet. The Exenatide group and diabetes group were subcutaneously administered with Exenatide at a dose of 5 μg/kg twice a day. The control group was treated with same amount of saline. Ten weeks later, all the rats were sacrificed and the pancreatic tissues were harvested for routine pathological examination. Immunohistochemical method was used to detect the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and type III collagen protein in pancreatic tissue, and ELISA was applied to measure the expression of matrix metalloprotei-nase-2 (MMP-2) and MMP-9 in pancreatic tissue.ResultsIn control group, there was no pathological change in pancreatic tissue. In Exenatide group, chronic inflammatory changes were observed; and the degree of inflammatory changes were much severe in diabetes group, and the pathological scores were gradually increased in the 3 groups (P<0.05). The expressions of MMP 2 in pancreatic tissue in control group, Exenatide group, diabetes group were (186.98±23.24), (306.07±59.82), (365.08±89.55)μg/L, and the expressions of MMP-9 were (49.37±7.08), (67.24±14.73), (87.37±13.39)μg/L. The values were significantly higher in Exenatide group and diabetes group than those in control group (P<0.05), but the difference between the two groups was not statistically significant. The numbers of α-SMA positive cells per high power field were (13.4±5.97), (29.5±8.80), (79.3±27.23) in control group, Exenatide group, diabetes group, and the numbers of type III collagen positive cells were (10.6±4.93), (29.3±12.95), (56.0±27.21). The values were significantly higher in Exenatide group than those in control group, and the values were significantly higher in diabetes group than those in Exenatide group (P<0.05).ConclusionsLong-term subcutaneous injection of Exenatide may activate pancreatic stellate cells and cause expression of α-SMA, III collagen protein, and MMP-2, MMP-9, then induce chronic inflammatory changes.

Pancreas; Astrocytes; Exenatide; Pathology; Rats

2013-06-03)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.007

湖南省自然科学基金(12JJ5052)

410013 湖南长沙，中南大学湘雅三医院普外科

余枭，Email: yuxiaoyx4@126.com