吡格列酮抑制胶原诱导的关节炎大鼠滑膜S100A8/A9 mRNA的表达

黄火高，韩春光，刘永学，郭启煜

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种累及外周小关节为主的进行性破坏性的慢性自身免疫性炎性疾病。尽管近年对RA机制的进一步认识推动对该病治疗的进展，但是目前临床上仍存在诸多难题，RA的详尽发病机制仍有待深入研究[1]。过氧化物酶体增殖物活化型受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)是一类配体依赖的核受体。研究表明，激活PPAR γ可调控多种基因表达，并产生抗炎作用[2]。PPAR γ激动剂吡格列酮可显著抑制胶原诱导的关节炎(collageninduced arthritis，CIA)[3]。S100A8/A9 为一组钙卫蛋白，是类风湿关节炎中重要炎性介质[4]。本实验通过大鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，检测PPARγ激动剂吡格列酮对滑膜表达S100A8/A9 mRNA的影响，以探讨 PPARγ在RA中作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Wistar雄性大鼠(200±20)g，由军事医学科学院实验动物中心提供并饲养。

1.1.2 主要试剂 吡格列酮由江苏恒瑞医药股份有限公司惠赠。牛Ⅱ型胶原及不完全弗氏佐剂为美国Sigma产品。总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen。逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒和DL2000 DNA Marker为大连宝生物工程有限公司产品。引物由北京赛百胜生物有限公司合成并纯化。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和用药方法 将20只大鼠编号。随机抽取3只大鼠饲养至首批关节炎大鼠到达实验终点时作为正常对照组。余下17只大鼠经二次强化免疫后每日依次查看，以发生关节炎时间先后顺序再随机入组，分为模型对照组、吡格列酮用药大剂量组[20 mg/(kg·d)]和吡格列酶用药小剂量组[4 mg/(kg·d)]，进入实验的大鼠每组各3只，多余大鼠废用。将吡格列酮均匀混悬于1%羧甲基纤维素钠悬液中。吡格列酮用药组大鼠入组当天开始灌胃给药，1/d，连续14 d。模型对照组大鼠以同样方式给予等体积的1%羧甲基纤维素钠混悬液。

1.2.2 CIA模型诱导 依据本实验组建立的方法[5]制作制备胶原乳液并诱导CIA模型。简述如下:大鼠麻醉后，将背部及尾根部去毛，按照每只250 μl皮内多点注射Ⅱ型胶原乳液(4 mg/ml)进行初次免疫，间隔7 d后二次注射强化免疫。

1.2.3 RT-PCR检测滑膜目的基因mRNA表达二次强化免疫大鼠关节炎发作满14 d后将大鼠麻醉，打开胫跗关节，沿着骨骼周边用眼科剪与手术刀片剪切滑膜及其周围组织，于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中快速洗涤1遍后立即转入装有1 ml Trizol试剂的组织匀浆器中研磨，以抽提总RNA。检测获得的RNA量和纯度后以20 μl体系将3 μg的 RNA逆转录成 cDNA模板，用于PCR检测。所用引物序列和PCR条件见表1。除了退火温度和循环数，反应程式其他部分均相同:94℃预变性2 min进入循环，94℃变性45 s，不同温度下退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后72℃再延伸5 min，降至4℃。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳并成像分析，以美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)开发的软件ImageJ对产物条带吸光度值进行计算。结果以“目的基因/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)”比值表示。

表1 所用引物序列资料及PCR条件

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示。两组比较用t检验，两组以上比较用单因素方差分析，后续两两比较用最小显著性差异法(least-significant difference，LSD)检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIA 滑膜 PPARγ mRNA表达变化 PPARγ mRNA在正常对照组大鼠滑膜仅极少量表达(0.03±0.01)，而在模型对照组大鼠滑膜表达明显增高(0.14±0.01)，两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 正常滑膜S100A8 mRNA和S100A9 mRNA固有表达 正常对照组大鼠关节滑膜仅微量表达S100A8 mRNA(0.01±0.01)和S100A9 mRNA(0.20±0.07)。

2.3 关节炎滑膜S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的表达及吡格列酮的影响 CIA后14 d模型对照组大鼠滑膜组织表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA显著增高;吡格列酮小剂量用药组滑膜表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA明显低于模型对照组，抑制率分别为62.7%和34.2%;吡格列酮大剂量用药组滑膜表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA显著低于模型对照组，抑制率分别为82.1%和71.9%(P＜0.01，图1及表2)。吡格列酮大、小剂量组之间比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 吡格列酮对滑膜组织S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表达的影响

表2 各组大鼠滑膜组织S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表达结果(±s)

表2 各组大鼠滑膜组织S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表达结果(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.01

组 别S100A8 mRNA S100A9 mRNA模型对照组1.23 ±0.06 1.07 ±0.11吡格列酮小剂量组 0.46 ±0.08* 0.71 ±0.06*吡格列酮大剂量组 0.22 ±0.02* 0.30 ±0.03*

3 讨论

S100A8 mRNA和S100A9 mRNA属于S100家族，主要表达于粒细胞和单核细胞，与髓系细胞分化密切相关[4-6]。研究发现S100A8 mRNA和S100A9 mRNA与滑膜炎的严重程度密切相关[4]，其中S100A8 mRNA可加重病情并介导RA的骨破坏[6]。

核受体PPAR γ的主要功能是在mRNA水平调控基因的表达;吡格列酮是PPARγ高亲和力的配体[2]。本实验选择吡格列酮，旨在通过观察该配体激活PPARγ后目的基因表达的变化，以研究PPARγ激活的效应。PPARγ mRNA在CIA发生14 d后表达明显增高，为药物发生作用提供了基础。本研究结果显示，吡格列酮明显抑制S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的表达，并存在剂量依赖关系，提示激活PPARγ可抑制炎性趋化物S100A8/A9 mRNA的表达。激活PPARγ本身有促分化特性[2]。巨噬细胞分化成熟后S100A8 mRNA和S100A9 mRNA不再表达[7]，吡格列酮抑制 S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表达提示其具有促巨噬细胞分化成熟的作用。文献表明，成熟的巨噬细胞炎性反应明显减弱，可能是导致某些急性炎症反应自发缓解重要机制[8]。本小组研究曾发现，吡格列酮可能通过促巨噬细胞成熟而减轻痛风性炎症[9]。RA滑膜炎症持续放大而不能自发缓解，提示巨噬细胞功能可能存在异常。本文初步探讨了PPARγ激活后对CIA滑膜S100A8/A9 mRNA表达的影响，意在为进一步的研究建立基础，深入研究PPARγ、S100A8/A9 mRNA以及巨噬细胞分化在RA中的作用，可深化对RA发病机制的认识，为RA治疗新药研究提供新的思路。

总之，PPARγ激动剂吡格列酮可明显抑制RA模型滑膜S100A8/A9 mRNA的基因表达，其改善RA炎症的机制可能涉及对巨噬细胞分化的调控。人类RA病程与巨噬细胞的分化的关系、如何更有效改善滑膜巨噬细胞功能以及PPARγ激活后如何实现对S100A8/A9 mRNA的内在调控作用则是需要我们深入认识的新领域。

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