糖尿病肾病患者尿足细胞相关蛋白nephrin的表达及意义

程 亮，俞伟男，胡 文，柏 凤，郝海荣

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见的微血管并发症之一，也是终末期肾脏疾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。以往的研究认为肾小球细胞外基质的堆积、系膜增生、基底膜增厚是DN的主要病理特征。近年来的研究认为足细胞是肾小球滤过屏障通透性改变和蛋白尿发生过程中的关键细胞[1]。Nephrin是足细胞裂孔隔膜上重要的功能蛋白分子。既往的动物实验研究结果显示足细胞表面nephrin蛋白的表达异常与蛋白尿的产生以及DN的病情进展相关，并且在DN早期大鼠尿液中即可检测到nephrin蛋白[2]。本研究通过检测不同DN患者尿液中nephrin水平，探讨尿nephrin表达在DN患者中的意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 病例来源于2010年10月－2011年10月在徐州医学院附属淮安市第二人民医院内分泌科住院的2型DM患者，共90例，男性45例、女性45例，年龄(52.31±8.65)岁，均符合1999年WHO制定的DM诊断和分型标准;正常对照组20例(NC组)，男性9例、女性11例，年龄(50.69±7.52)岁，为本院健康体检者，无心、肝、肾疾患。根据Mogenson分型标准，按照24 h尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion rate，UAER)结果将 90 例DM患者分为:无白蛋白尿组30例(DM组)，UAER＜20 μg/min;微量白蛋白尿组32 例(DN1 组)，20 μg/min≤UAER＜200 μg/min;大量白蛋白尿组28例(DN2 组)，UAER≥200 μg/min。排除标准:年龄在18岁以下或70岁以上者;妊娠或哺乳期妇女;近1个月内有糖尿病酮症、肝胆或泌尿系感染以及其他严重感染患者;严重心脑血管疾病、肿瘤、外伤、风湿性疾病、肾动脉狭窄和其他可能肾脏疾病患者。各组间年龄、性别构成比经过均衡性检验，差别无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.1.2 主要试剂 Nephrin定量酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒为美国R＆D System公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 所有入组患者留取晨尿10 ml，2 000 r/min离心5 min，收集上清液，－20℃保存备用，用于尿nephrin定量测定。

1.2.2 尿nephrin检测 将nephrin单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的nephrin与单抗结合，加入酶标抗体，形成免疫复合物连接在板上，加入酶底物 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB)，出现蓝色，加终止液，颜色变黄，用酶标检测仪在450 nm处测定吸光度，nephrin浓度与吸光度成正比，可求出样品中待测蛋白浓度。为了消除尿量的影响，尿nephrin质量分数以尿nephrin/尿肌酐(μg/mg)来表示，并分析尿 nephrin与β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)、尿 N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D glucosaminidase，NAG)和UAER的关系。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示。正常对照组与DM患者各组各项指标的比较采用两独立样本非参数检验，DM患者各组之间的比较采用单因素方差分析;相关性分析采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 入选研究对象的基本资料 入选的90例DM患者及正常对照组20例基本情况见表1。各组间年龄、性别构成无统计学差异。DM组、DN1组、DN2组患者空腹血糖、糖化血红蛋白、β2-MG、尿NAG、UAER和尿 nephrin/尿肌酐比值与 NC组相比，差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 DM患者各组与正常对照组资料

表2 DM患者各组与正常对照组的尿足细胞相关指标

2.2 DN患者尿nephrin排泄特征 NC组患者尿液中未检测到nephrin蛋白;DM组患者尿中可检测到少量nephrin蛋白，尿nephrin/尿肌酐为(9.42±2.95)μg/mg;DN1组患者尿nephrin排泄较DM组明显增加，尿nephrin/尿肌酐为(29.51±8.40)μg/mg;DN2组患者尿 nephrin排泄进一步增加，尿nephrin/尿肌酐为(59.48±11.98)μg/mg。DM 组、DN1组、DN2组组间尿nephrin/尿肌酐比值经统计学分析差异有统计学意义(P＜0.05)。

Spearman法相关分析显示，入选90例DM患者尿nephrin/尿肌酐比值与血肌酐、尿素氮、β2-MG、尿NAG、UAER均呈正相关(P＜0.05，表3)。

表3 DM患者各组尿nephrin/尿肌酐比值与Scr、BUN、β2-MG、尿 NAG、UAER 之间的相关性

3 讨论

足细胞是肾小球中一种高度特异、终末分化的细胞，与肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和毛细血管内皮细胞一起构成肾小球滤过膜。足细胞结构可分为细胞体、主突、足突3个部分，相邻足细胞的足突由裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)相连，构成一种拉链式结构，可阻止蛋白质等大分子物质的滤过。Nephrin是位于足细胞之间SD上的一种跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族，特异性表达于 SD上。Nephrin与 podocin、CD2AP相互作用形成复合体，将SD固定于足细胞的细胞骨架上，参与足细胞内外信号的传递过程。Nephrin结构中含有10个潜在的糖基化位点，可与带负电荷的糖基化产物结合，形成肾小球滤过膜的电荷屏障[3]。各种炎症和非炎症损伤引起足细胞表面nephrin表达异常，细胞外向细胞内骨架蛋白的信号传递发生障碍，足细胞骨架蛋白排列紊乱，足细胞的正常结构遭到破坏，与GBM的黏附作用减弱，从GBM剥离、脱落，肾小球正常滤过屏障功能受损，最终导致蛋白尿的产生[4]。既往的研究发现，nephrin的分布和表达异常与多种先天性及获得性蛋白尿的发生密切相关。近年来有研究证实nephrin蛋白异常表达也与DN蛋白尿的发生有关[5]。Welsh等[3]发现在DN早期肾小球肥大，足细胞代偿性合成功能增加，nephrin基因转录及蛋白表达增加;随着DN病情的进展，肾小球滤过率逐渐升高，足细胞的骨架蛋白重新分布，nephrin蛋白可从足细胞脱落随尿液排出体外。Zhang等[6]研究证实，在正常大鼠尿液中未发现nephrin排泄，而链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠造模早期尿液中即可检测到nephrin蛋白，随着DN病情进展，大鼠尿nephrin排泄逐渐增多，尿nephrin排泄与糖尿病肾病的病情进展呈正相关。Doublier等[7]研究发现，DN患者早期足细胞表面nephrin蛋白表达代偿性增加，足细胞骨架蛋白的重新分布引起nephrin蛋白与足细胞骨架蛋白解离，nephrin蛋白脱落随尿液排出体外，尿nephrin蛋白排泄增多;DN发展到晚期足细胞表面nephrin蛋白表达受抑制，尿nephrin蛋白排泄将有所下降。

本研究通过应用生物素-亲和素标记抗体-ELISA法测定DM患者尿液中nephrin蛋白的排泄，探讨尿nephrin检测在DM患者中的意义。实验中NC组尿液中未检测到nephrin蛋白，DM组尿液中检测到少量nephrin蛋白，DN1组尿中nephrin蛋白排泄明显增加，DN2组尿nephrin排泄进一步增加。而nephrin特异性表达于足细胞的SD上，提示尿nephrin可反映DM患者早期足细胞损伤。本研究发现，随着DN病情的进展，尿nephrin排泄有逐渐增多的趋势，尿nephrin/尿肌酐比值与尿NAG和β2-MG相关分析显示，尿nephrin/尿肌酐比值与尿NAG 呈正相关(r=0.80，P ＜0.01)，尿 nephrin/尿肌酐比值与β2-MG呈正相关(r=0.71，P＜0.01)，而尿NAG和β2-MG均是反应肾功能早期改变的敏感指标[9]，提示尿nephrin蛋白检测有可能成为一种无创性的监测DN患者早期肾脏损伤的指标。将尿nephrin/尿肌酐比值与UAER做相关分析，结果显示尿nephrin/尿肌酐比值与UAER呈正相关(r=0.87，P＜0.01)，提示尿nephrin蛋白随着尿白蛋白排泄的增加而增加。尿白蛋白排泄率是目前公认的DN诊断和分型指标，可反映DN的肾脏病变进展，由此推测尿nephrin蛋白的变化可反映DN的肾脏病变进展。

综上所述，尿nephrin可能成为监测DM患者早期肾脏损伤的一种无创性指标，对于发现早期糖尿病肾病、评估DN的病情进展和指导临床治疗有着重要的意义。

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