循环活化血小板的检测在脑梗死患者诊断与治疗中的临床研究

刘京伟

(山东省临沂市沂水中心医院，山东临沂276400)

脑梗死(cerebralinfarction，CI)多在动脉粥样硬化基础上发生，CI的重要病理基础为血管内血栓形成。血小板活化与脑梗死的发生、发展及预后密切相关。由于纤维蛋白原受体(fibrinogenreceptor，FBI－R)和P－选择素均可作为血小板活化的分子标志物，为此，观察121例CI患者循环活化血小板膜表面FBI－R和P－选择素的变化情况，旨在探讨其与CI之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象:入选121例CI患者均符合第四届全国脑血管病学术会议通过的诊断标准[1］。根据CT报告将其分为大面积梗死组(＞5cm2)41例，小面积梗死组(≤5cm2)52例，以及腔隙性梗死组28例，其中男73例，女48例，平均年龄(60.8±10.6)岁。对照组为同期体检未发现异常的健康人70例，其中男42例，女28例，平均年龄(60.4±11.3)岁。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器:FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2.2 主要试剂:①单克隆抗体(monoclonalanti body，McAb)包括异硫氰酸荧光素(fluoreszeinsothiocyanat，FITC)标记的抗血小板纤维蛋白原受体(FIB－R)的McAb(PAC－1FITC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗P－选择素的 McAc(CD62PPE)、Peridinin叶绿素蛋白(PerCP)标记的抗血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(CD61PerCP)、MIgGPE为藻红蛋白标记的鼠IgG，以上均为美国BD公司产品。②流式细胞仪荧光校准微球，美国BD公司产品。

1.2.3 精氨酰－天冬氨酰－丝氨酰多肽(ArgGly－Asp－Ser，RGDS)(FIB－R阻断剂)、人工合成的RGDS肽，为美国Sigma公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标本采集:所有CI患者急性发作24h内采集肘静脉血2mL，其余均为晨起空腹采集，经106mmol/L枸橼酸钠抗凝。

1.3.2 抗血小板McAc免疫荧光染色:在阴性对照管中加入PAC－1FITC、MIgGPE、RGDS和CD62PPE 和CD61Per-CP各10μL测定管中加入PAC－1FITC、CD62PPE和CD61 PerCP各10μL，然后加入5μL抗凝血混匀，置室温，避光反应20min，立即加入1%多聚甲醛(2～6℃)1mL并混匀，置4℃冰箱保存，24h内在流式细胞仪上进行检测。

1.3.3 流式细胞术分析活化血小板:用荧光微球校准流式细胞仪后，将上述用荧光素标记的抗血小板McAb免疫荧光染色的标本在流式细胞仪上测定，记数1万个血小板，以CD61PerCP和侧向散射光双参数设定血小板门，分析FIBR(PAC－1)和CD62P阳性血小板百分率。

1.4 统计学原理:统计学分析采用统计软件APSS10.0For Windows，实验数据以M(全距)表示，多组间资料分析采用方差分析检验。

2 结果

CI患者较对照组FIB－R表达差异有统计学意义，尤其是急性期(P＜0.01)，见表1。在不同梗死面积的梗死组之间，FIB－R表达水平差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。各组之间P－选择素表达水平均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 CI患者与对照组循环血小板膜面积FIB－R和P－选择素的表达M %

表2 不同梗死面积CI患者循环血小板膜面积FIB－R和P－选择素的表达M %

3 讨论

脑梗死多在动脉粥样硬化基础上发生，动脉粥样硬化后，由于血管壁内皮细胞受损，血管胶原暴露与血小板接触面增加，易导致血管内血栓，在这一过程中血小板的活化起重要作用。活化血小板与静止血小板相比，其膜糖蛋白分子的种类、数量、分布和构型等出现显著变化，流式细胞技术作为一种高效、快速、多参数分析的先进技术，可以非常灵敏地检测到活化血小板膜表面糖蛋白分子的变化，从而可以精确判断血小板的功能状态[2］。FIB－R和P－选择素存在于血小板膜表面，是血小板活化的两个较敏感的分子标志物。本组研究结果显示，CI患者较对照组血小板膜表面FIB－R的表达显著增高，FIB－R增高表明血小板处于活化状态，并且在急性期较恢复期显著增高，所以活化的血小板是CI的一个重要的危险因素[3］。而CI患者血小板膜表面P－选择素的表达水平较对照组未见明显增高，起因可能是循环血液中活化血小板膜表面P－选择素易被清除[4］。同时Michelson等[5］还证实P－选择素被清除的活化血小板仍能继续循环于血液中发挥其功能。因此P－选择素并非一种循环中脱颗粒血小板检测的理想标志物。另外，FIB－R与CI患者的梗死面积密切相关，梗死面积越大，FIB－R也越高，预后也越差。CI患者血小板处于高度活化状态，血小板表面质膜结合多种凝血因子，如纤维蛋白原、因子Ⅴ、因子Ⅺ等，可以使活化的血小板与中性粒细胞和/或单核细胞黏附聚集，可促进血中纤维素的形成并募集其他白细胞形成凝块，是栓子增大，梗死面积增大，病情加重[6］。由于FIB－R增高，血小板活化，产生更多的活性物质如血栓素A2，从而加快栓子的形成。另外CI患者由于缺血、缺氧，病变部位的血管内皮细胞受损，使血管内皮的花生四稀酸转变为前列腺素减少，而前列腺素有抗血小板聚集的功能。动态检测CI患者的FIB－R，一方面有助于患者病情轻重程度的判定，另一方面可以了解CI患者血小板的活化情况，即时调节抗血小板治疗，以便改善CI的预后。由于动脉粥样硬化患者中动态检测FIB－R，即时给予抗血小板治疗，有助于预防CI的发生。

[1]全国第四届脑血管病学术会议.各类脑血管病诊断要点[J］.中华神经科杂志，1996，12(6):379 －380.

[2]王建中，曹凌，贺茂林，等.流式细胞术三色分析循环活化血小板及其在却学性脑血管病中的临床意义[J］.中华医学杂志，2000，80(7):499 －502.

[3]丁志祥，张乐之，王鸿利.血小板平均面积检测的临床意义[J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25(4):316－318.

[4]Michelson AD，Barnard MR，Hechtman HB， et al． In vion tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface P－ selectin but continue to circulate and function［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1996， 93( 21) : 11877 － 11882．

[5]Michelson AD． Flow cyrometric assessment of glycoprotein movements in platelets［J］． Platelets，1997，8( 2) : 105 － 115．

[6]丁志祥，张乐之，凌励.脑梗死病人平均血小板体积的改变及临床意义[J］.中西医结合心脑血管病杂志，2003，1(11):637－638.