RUNX3蛋白在结直肠腺癌中的表达及临床意义

薛军 武雪亮 贾光辉 王立坤 赵秀芳

结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势［1］，其5年生存率徘徊在50% ～60%［2］。结直肠肿瘤的复发和远处转移是结直肠癌患者预后不良的主要原因。抑癌基因RUNX3是新近发现的一个肿瘤抑制基因，能调控细胞的生长发育和细胞的凋亡，对细胞的信号转导和其他生物学效应有着重要而复杂的转录调节作用［3］。它的异常表达和人类的多种恶性肿瘤的发生、发展有密切关系［4］。因此推测RUNX3蛋白在结直肠癌的形成和发展中具有重要作用。本研究应用免疫组织化学法检测了RUNX3蛋白在结直肠癌的常见类型腺癌组织和结直肠正常组织中的表达情况，结合临床病理资料，探讨其与结直肠腺癌发生、浸润和转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取60例蜡块标本，均来自河北医科大学第四医院外二科、河北北方学院附属第一医院普外科2008年1至12月的手术切除标本。癌标本取白肿瘤中心处，正常组织标本取自距肿瘤边缘＞10 cm处。所有病例均经病理证实，无其他部位原发肿瘤，均为首次诊治患者，术前无放疗、化疗和免疫治疗史。标本取材后，部分置于液氮中速冻，然后转到-80℃冰箱中保存;部分标本用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。

1.2 试剂与方法 采用免疫组化(SP-9000通用型二步法检测)。1抗RUNX3兔抗人单克隆抗体购于北京中衫金桥生物技术有限公司，二氨基联苯胺(DAB)显色剂购于TIANGEN公司。实验步骤严格按试剂盒说明书操作，采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，采用已知的阳性片作为阳性对照。

1.2.1 收集结直肠腺瘤组织及结直肠癌组织组织标本蜡块并切片:切片厚度4μm。苏木素-伊红(hematoxylin-esin，HE)染色，光学显微镜下观察做出病理诊断。

1.2.2 免疫组化方法(SP-9000通用型二步法检测)测各组RUNX3蛋白表达。将标本置于80℃烤箱中烤片30 min;然后脱水、水化140℃高压蒸汽枸橼酸缓冲液修复，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶;PBS洗3次，加入一抗，4℃冰箱过夜;PBS洗3次，加入二抗，PBS洗3次。DAB工作液室温显色，显微镜下观察，苏木素复染，1%的盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗5 min;梯度乙醇脱水、松节油透明，中性树胶封片。阴性对照为PBS代替一抗。RUNX3免疫组织化学染色以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

1.3 结果判定 结果判定参考Dorudi等的方法，综合考虑阳性细胞数和染色强度来判定结果:计算阳性细胞百分数并赋予分值，≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分;观察着色强度并赋予分值，无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深黄色为3分。两者相乘，0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为(++)，9～12分为(+++)，(+)～(+++)均视为阳性。由3名有经验的病理医师独立阅片，确定免疫组织化学检测结果。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料应用χ2检验或Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测RUNX3在结直肠癌中的表达 结直肠癌中RUNX3的表达主要定位于细胞核，在60例标本中，RUNX3蛋白在正常组织和结直肠癌组织中的阳性率分别是86.67%和38.33%。RUNX3在癌旁正常粘膜表达阳性率明显高于结直肠腺癌中的表达，差异有统计学意义(P=0.005)。见表1，图1。

2.2 RUNX3蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的关系 免疫组织化学法检测结果经统计学分析显示，RUNX3的表达与结直腺肠癌的TNM分期、肠壁侵润深度、淋巴结转移、肝转移呈负相关(P＜0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、分化程度和组织学类型无关(P＞0.05)。见表2。

图1 免疫组化RUNX3在结直肠组织中的表达(IHC×400)

表1 RUNX3蛋白在结直肠癌及正常组织表达的阳性率

表2 RUNX3蛋白在结直肠癌组织中的表达与临床病例参数之间的关系

3 讨论

RUNX3基因系RUNX一族，位于人染色体lp36.1上，全长约67kb，含有6个外显子及Pl、P2两个启动子。Pl启动子含有一个E盒并有大量的T细胞和B细胞转录因子(Ikaros、EtS、CREB/ATF)结合位点。P2启动子含有CCAAT盒、E盒及SP1和Egr21结合位点，主要转录RUNX3mRNA。两个启动子的GC含量不同，P2启动子GC含量达64%，较P1启动子高。它与靠近外显子2部位的CpG岛一样，理论上更易发生甲基化［5］。RUNX3基因的编码产物RUNX3蛋白是由4个氨基酸残基形成的α、β亚单位构成的异二聚体，其氨基末端含有一个由128个氨基酸组成的包含一个S型免疫球蛋白折叠的RD(Runt domain)保守域。亚单位α介导RD(Runt domain)与DNA的结合以及蛋白之间的相互作用;β能稳定Runx3蛋白并增强RD与靶 DNA 的结合力［6］。

RUNX3基因作为一种新近发现的肿瘤抑制基因，能调控细胞的生长、发育及凋亡，对细胞的信号转导和其他生物学效应有着非常复杂的转录调控作用。因其表达下调在人类多种恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用而受到更多关注。目前，研究比较深入的是其在转录生长因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)介导的细胞生长调控中的作用。RUNX3蛋白是TGF-β信号转导通路下游的一个转录因子，而TGF-β是许多细胞生长的有效抑制因子，该信号转导通路的紊乱可导致多种肿瘤的发生［7］。TGF-β信号在细胞内的转导主要由人信号转导分子Smad蛋白介导，而在TGF-β信号通路中，Smad4是个重要的转录因子。TGF-β与 RUNX3相互作用后可以激活Smad2和Smad3，从而诱导相关目的基因在细胞核内的转录和表达［8，9］。因而认为RUNX3基因在因TGF-β信号通路及Smad蛋白致瘤作用中起承担非常重要的角色［10］。此外，Min等［11］发现RUNX3在MST(mammaliansterile20-like kinase)信号通路中是一个重要且在进化上保守的元件。其中，SAV1/WW45(salvador homolog 1，WW45)能促进MST2和RUNX3之间的密切联系，而MST2反过来也可以刺激SAV1-RUNX3相互作用。表明RUNX3作为MST信号通路的终端效应器而且在MST和SAV1的协助下能够诱导细胞凋亡。还有研究发现Runx3可以通过调节TIMP-1、VEGF、CRK-11等分子的表达抑制胃肠道肿瘤细胞侵袭转移的能力。

本实验研究表明结直肠腺癌组织中RUNX3蛋白表达低于正常组，说明RUNX3蛋白可抑制结直肠腺癌的发生，在病理状态下呈低表达，同时RUNX3蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭力呈负相关，对结直肠腺癌的侵袭转移具有阻遏作用，有望成为结直肠腺癌预后判断的新指标。

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7 Miyasono K，Suzuki H，Imamura T.Regulation of TGF-beta signaling and its roles in progression of tumors.Cancer Sci，2003，94:230-234.

8 Ito Y，Miyazono K.RUNX transcription factors as key targets of TGF-beta superfamily signaling.Curr Opin Genet Dev，2003，13:43-47.

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11 Min B，Kim MK，Zhang JW，et al.Identification of RUNX3 as a component of the MST/Hpo signaling pathway.JCell Physiol，2011.［Epub ahead of print］