软脂酸抑制C2C12肌细胞PGC-1α的表达

牛尚梅 马慧娟 刘晶 高哲 李彩英 马博清

游离脂肪酸(FFA)水平升高在肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病中发挥重要作用［1］。不同类型脂肪酸与胰岛素敏感性关系不尽相同，其中长链饱和与不饱和脂肪酸与胰岛素抵抗(IR)关系密切。实验表明给予大鼠高饱和脂肪酸饮食可以导致大鼠IR［2］，具体机制尚不十分清楚，可能与骨骼肌过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)的转录调控有关。PGC-1α是一种核转录共激活因子，其在线粒体功能和IR中的作用成为近年来研究的热点。动物研究发现Zucker糖尿病肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α表达下调［3］。高脂与PGC-1α表达，IR关系密切。本研究拟采用不同类型长链脂肪酸培养C2C12肌细胞，探讨脂肪酸类型及浓度对骨骼肌PGC-1α表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 实验用脂肪酸购自Sigma公司，C2C12细胞株购自北京协和细胞库。目的引物由上海生物工程公司合成，β-actin 上游引物:5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物:5’-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3’;PGC-1α 上游引物5’-TCAGTCCTCACTGGTGGACA-3’，下游引物 3’-TGCTTCGTCGTCAAAAACAG-3’。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代:C2C12肌细胞贴壁生长于含20%小牛血清、0.6/L谷氨酞胺，6.672/LHEPES，100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640中，于37℃，5%CO2孵箱培养。以1X106/培养瓶传代细胞，3天后分别予 0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L 软脂酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸和亚油酸处理细胞，持续24 h孵育。

1.2.2 试验分组:对照组(Con)，软脂酸组(C16∶0)、硬脂酸组(C18∶0)、棕榈酸(C16∶1)组、油酸组(C18∶1)以及亚油酸组(C18∶2)，均分别采用0.25、0.5和0.75 mmol/L三个浓度孵育C2C12细胞。

1.2.3 荧光定量PCR分析:取RNA溶液4μl，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，明显可见28S、18S条带，且28S为18S条带的两倍，5S条带较弱，且弥散，表明RNA降解较少，完整性良好。用756型紫外分光光度计分别测定 OD260与 OD280，选用OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA用作反转录。PCR热循环参数:96℃ 4min，然后三步反应:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，进行40个循环，于每个循环的第三步72℃ 30 s收集荧光信号。扩增完毕后，进入结果分析界面，以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(RQ值)，将RQ值用于统计分析。

1.3 统计学分析应用SPSS13.0软件统计，计量资料以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度脂肪酸对肌细胞PGC-1αmRNA表达的影响在脂肪酸浓度为0.25 mmol/L时，软脂酸组(C16∶0)、硬脂酸组(C18∶0)、棕榈酸组(C16∶1)、油酸组(C18∶1)以及亚油酸组(C18∶2)的PGC-1αmRNA表达与对照组比较均无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

在脂肪酸浓度为0.5 mmol/L和0.75 mmol/L时，软脂酸组PGC-1αmRNA表达较对照组降低(P＜0.05);棕榈酸组、油酸组、亚油酸组PGC-1αmRNA表达与对照组和软脂酸组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 软脂酸孵育时间对PGC-1αmRNA表达的影响 软脂酸培养的肌细胞，在1 h，PGC-1αmRNA表达较0 h差异无统计学意义(P ＞0.05)，在培养6 h、12 h、24 h PGC-1α mRNA 表达较0 h。1 h降低，而24 h降低最明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表1 不同浓度脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表达变化比较

表1 不同时间脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表达变化比较

3 讨论

FFA水平升高可能导致肌内脂质堆积，从而产生IR，具体机制尚不十分清楚，可能与骨骼肌PGC-1α的转录调控有关。血中FFA是由不同长度和饱和度的脂肪酸组成，根据碳链的不同分为短链(2～4)、中链(6～8)和长链(10～24)，根据有无双键分为饱和与不饱和脂肪酸。不同类型脂肪酸与胰岛素敏感性关系不尽相同，其中长链饱和与不饱和脂肪酸与胰岛素抵抗关系密切。胰岛素抵抗者骨骼肌甘油三酯以饱和脂肪酸增加为主，并且与胰岛素抵抗有直接关系［4］。骨骼肌PGC-1α表达下降使线粒体氧化葡萄糖和脂肪酸能力降低，过多脂质在相应组织骨骼肌堆积，导致胰岛素抵抗［5］。研究发现给正常人输入脂肪酸混合剂24小时降低了肌肉PGC-α和氧化磷酸化基因的表达［6］，通过慢性运动可以改变PGC-1α的表达，改善胰岛素敏感性［7］。体外实验证实软脂酸可以诱导骨骼肌细胞 IR，而油酸可以逆转这一作用［8］，软脂酸亦可以诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗，其机制可能与激活JNK通路有关［9］。本研究发现饱和脂肪酸，软脂酸孵育的C2C12肌细胞PGC-1α的表达下降，这与Crunkhorn等［10］的研究结果一致。而不饱和脂肪酸，棕榈酸组、油酸组、亚油酸组培养的肌细胞PGC-1α的表达较对照组无明显变化。说明脂肪酸诱导的PGC-1α的下降依赖于他们的结构或特殊的氧化产物。

Coll等［11］研究了不同时间软脂酸对骨骼肌细胞PGC-1α表达的作用，发现1 h无变化，4 h(2倍，有意义)和8 h(1.5倍，有意义)轻度变化，较大下降在16 h后，16 h后表达下降55%。本研究显示软脂酸对PGC-1α的抑制作用出现在6 h，24 h抑制作用最强，与上述结果类似，说明饱和脂肪酸对PGC-1α的抑制作用有时间依赖性，可能与底物的作用或氧化增加有关。本研究采用250、500、700μmol/L三个浓度，在低浓度(250μmol/L)PGC-α表达无明显变化，但在500μmol/L即出现PGC-1α表达下降，700μmol/L浓度时更明显。已知在肥胖和2型糖尿病者血浆 FFA升高，一般都超过 500μmol/L，而本研究在500μmol/L已经出现 PGC-1α表达下降，分析可能是血浆中FFA是不同类型脂肪酸的总合，包括长链、短链、饱和以及不饱和。所以单纯一种脂肪酸来说500μmol/L的浓度已经是比较高的剂量，从而影响了PGC-α的表达，而且这种影响与脂肪酸浓度有关。

软脂酸诱导的PGC-1α表达下降可同时伴有许多三羧酸循环和氧化磷酸化基因的下降，基因敲出小鼠PGC-1α表达下降使线粒体基因表达和骨骼肌数量降低［13］。所以软脂酸诱导的PGC-1表达下降，可能导致线粒体功能异常，并且这种异常与胰岛素抵抗有关，但具体的作用机制仍然不清楚，需要进一步的研究。

1 Boden G，Shulman GI.Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes:defining their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction.Eur JClin Invest，2002，32(Suppl3):14-23.

2 宋光耀，高宇，周宇，等.高饱和脂肪酸、高不饱和脂肪酸、高糖不同饮食诱导高血压伴胰岛素抵抗大鼠的研究.中国病理生理杂志，2006，22:2270-2273.

3 Sriwijitkamol A，Ivy JL，Christ-Roberts C，et al.LKB1-AMPK signaling in muscle from obese insulin-resistant Zucker rats and effects of training.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2006，290:E925-932.

4 Manco M，Mingrone G，Greco AV，et al.Insulin resistance directly correlates with increased saturated fatty acids in skeletal muscle triglycerides.Metabolism，2000，49:220-224.

5 Barroso E，Rodríguez-Calvo R，Serrano-Marco L，et al.The PPARβ/δ activator GW501516 prevents the down-regulation of AMPK caused by a high-fat diet in liver and amplifies the PGC-1α-Lipin 1-PPARα pathway leading to increased fatty acid oxidation.Endocrinology，2011，152:1848-1859.

6 Richardson DK，Kashyap S，Bajaj M，et al.Lipid infusion decreases the expression of nuclear encoded mitochondrial genes and increases the expression of extracellular matrix genes in human skeletal muscle.J Biol Chem，2005，280:10290-10297.

7 Li L，Pan R，Li R，et al.Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α)deacetylation by physical activity:intact adipocytokine signaling is required.Diabetes，2011，60:157-167.

8 Coll T，Eyre E，Rodriguez-Calvo R，et al.Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells.JBiol Chem，2008，283:11107-11116.

9 Davis JE，Gabler NK，Walker-Daniels J，et al.The c-jun N-terminal kinase mediates the induction of oxidative stress and insulin resistance by palmitate and toll-like receptor 2 and 4 ligands in 3T3-L1 adipocytes.Horm Metab Res，2009，41:523-530.

10 Crunkhorn S，Dearie F，Mantzoros C，et al.PGC-1 expression is reduced in obesity:potential pathogenic role of saturated fatty acids and p38 MAPkinase activation.JBiol Chem，2007，282:15439-15450.

11 Coll T，Jove M，Rodriguez-Calvo R，et al.Palmitate-Mediated Downregulation of Peroxisome Proliferator–Activated ReceptorγCoactivator 1α in Skeletal Muscle Cells Involves MEK1/2 and Nuclear Factor-κB Activation.Diabetes，2006，55:2779-2787.

12 Lin J，Wu PH，Tarr PT，et al.Defects in adaptive energy metabolism with CNS-linked hyperactivity in PGC-1alpha null mice.Cell，2004，119:5-7.