阿托伐他汀对oxLDL诱导泡沫细胞Lkn-1表达的影响

巨名飞 崔春燕 李金萍 张爱文 侯瑞田

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病，炎症反应伴随其发展始终［1］。炎性因子和炎性细胞间相互作用是AS发病机制的核心。抗炎治疗作为一种有效的治疗手段，越来越受到人们的重视。白细胞诱素-1(Lkn-1)是新发现的炎性因子，具有强烈趋化白细胞向炎症损伤部位快速聚集，促使前炎性介质释放和血栓形成的作用。国外有报道Lkn-1与AS的发生发展有着密切关系［2］。阿托伐他汀为，除具有调酯作用外，还具有抗炎、改善血管内皮功能、抗氧化、调节细胞增殖等作用，近年他汀抗炎作用越来越受心血管领域重视，在降低心血管事件发生率上起着重要作用［3，4］。本实验以ox-LDL诱导的U937细胞形成的泡沫细胞为AS实验模型，观察阿托伐他汀对ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞过程中炎性因子Lkn-1表达的影响，进而研究其动脉粥样硬化过程中的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 阿托伐他汀提取物辉瑞公司馈赠。佛波酯购自Sigma公司。鼠抗人Lkn-1抗体购自R＆D公司。RPMI-1640培养基和Trizol购自Gibco公司。M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP、Oligo(dT)购自 Promega公司。引物由上海生工合成。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 氧化型低密度脂蛋白制备 低密度脂蛋白(LDL)的纯化、氧化修饰及鉴定采集健康成人空腹12 h后新鲜混合静脉血，加入100 mmol/L EDTA抗凝。采用超速离心法分离离心速度42 000 r/min获得LDL提取液，经琼脂糖电泳显示为单一蛋白带。将LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS溶液(pH值7.4)中，37℃温育24 h。氧化后的LDL置含200μmol EDTA的PBS中透析24 h，PBS再透析24 h，过滤除菌后4℃保存。LDL中的脂过氧化物在氧化过程中增加，颜色也由逐渐变浅。琼脂糖电泳显示，OxLDL的电泳迁移速率快于未氧化的LDL。

1.3 U937细胞培养及诱导分化 人U937单核细胞株由吉林大学基础免疫教研室馈赠。细胞悬浮样生长于含10%高温灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。每2～3天换液1次。

1.4 实验分组 每次实验前用100 nmol/L佛波酯孵育U937单核细胞72 h，使其诱导分化为巨噬细胞，换无血清24孔培养板培养24 h后加处理因素。将细胞随机分为5组，正常对照组(对照组):U937巨噬细胞置于无血清24孔培养板培养中。模型组(ox-LDL组):在U937巨噬细胞的培养液中加入ox-LDL 100 mg/L，阿托伐他汀低浓度组(AV1组):在培养的细胞中加入阿托伐他汀(0.1μmol/L)，然后加入ox-LDL 100 mg/L。阿托伐他汀中浓度组(AV2组):在培养的细胞中加入阿托伐他汀的浓度为1μmol/L。阿托伐他汀高浓度组(AV3):在培养的细胞中加入阿托伐他汀10μmol/L。各组设3复孔，于5%CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h。

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Lkn-1蛋白的表达 收集各组细胞上清液，包被:于96孔酶标板每孔中加各组上清100μl及0.01%碳酸盐buffer(PH9.6)100μl，4℃过夜。弃上清，PBST缓冲液洗3次，5 min/次。加入封闭液(0.1%BSAPBS)100μl/孔，37℃ 30 min。弃上清，PBST缓冲液洗3次，5 min/次。加入一抗鼠抗人Lkn-1工作液(由鼠抗人Lkn-1贮存液按1∶100稀释而成)100μl/孔，37℃ 2 h。弃上清，PBST缓冲液洗3次，5 min/次。加入抗兔的 HRP标记的二抗，100μl/孔，37℃ 2 h。弃上清，PBST缓冲液洗3次，5 min/次。显色:加入显色剂100μl/孔，37℃ 30 min;产物颜色逐渐由无色转为橙黄色。加终止液50μl/孔，用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。测量:酶标仪测定OD 490 nm值，记录结果。

1.6 逆转录-聚合酶链反应检测Lkn-1 mRNA的表达 收集对照组和实验组细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，溶于无Rnase水中，紫外分光光度计测定A260/A280的比值在1.8～2.0。分别取1μg RNA在20μl反应体系中逆转录合成cDNA;取5μl cDNA于50μl反应体系中进行PCR扩增Lkn-1引物，上游:5’-ATCCTACACCCCACGAAGCAT-3 ’，下游:5’-AATTCTTCCTGGTCTTGATCCG-3’(169bp)。内参GAPDH引物，上游:5’-ACCACAGGCCATGCCATCAC-3’，下游:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(450bp)。PCR产物经 2%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)3 V/cm电泳分离，对电泳条带进行扫描定量分析并摄像，应用作为GAPDH内参照。Lkn-1 mRNA表达分析:采用Image Master VDS进行光密度扫描(IOD)，以各组Lkn-1条带和相应GAPDH的条带的IOD比值表示Lkn-1表达的强弱。

1.7 统计学分析 应用SPSS12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U937单核细胞分化为巨噬细胞、泡沫细胞形态学改变光学显微镜下U937细胞呈圆形、悬浮状态，经100 nmol/L PMA诱导分化后，细胞形态变为梭形、椭圆形或不规则形，由悬浮变为贴壁状态，且伸展伪足，细胞体积增大，表明已经分化为巨噬细胞。再与100 mg/L ox-LDL孵育后油红O染色可见细胞内含许多红色脂类颗粒物质，提示AS泡沫细胞模型制备成功。

2.2 ELISA方法检测Lkn-1蛋白的表达结果表明 正常状态下，U937巨噬细胞可以表达少量的Lkn-1。ox-LDL组与C组比较Lkn-1表达明显增加(P＜0.05)，应用不同浓度的阿托伐他汀干预后，与ox-LDL组相比较，Lkn-1的表达水平明显下降(P＜0.05)。且随阿托伐他汀浓度的增加，Lkn-1的表达呈逐渐下降趋势。见表1。

表1 不同浓度的阿托伐他汀对Lkn-1蛋白表达的影响

2.3 RT-PCT检测Lkn-1基因的结果 C组中Lkn-1条带颜色较浅，ox-LDL作用U937MΦ24 h后条带颜色明显加深;加用不同浓度的阿托伐他汀后，Lkn-1条带颜色比ox-LDL组变浅。ox-LDL组与C组比较Lkn-1表达明显增加(P＜0.05)，这与ELISA结果基本一致。见表2。

表2 5组细胞上清液中Lkn-1与内参积分光密度比值

3 讨论

动脉粥样硬化是一种损伤性炎性反应疾病，在其形成与发展过程中有大量炎性因子的参与［5］。炎性因子在AS中的作用已受到广大学者的重视。Lkn-1是新发现的由巨噬细胞分泌的CC趋化因子，受体为CCR1或CCR3［6］。功能与MCP-1功能相近，对人外周血中性白细胞、单核细胞和淋巴细胞具有强大的化学趋化性，参与炎症免疫反应。此外，还可诱导其它炎症因子的表达，促进血栓形成等作用。国外有报道Lkn-1和与动脉粥样硬化的关系密切。它可以强烈趋化血液循环中的白细胞向炎症部位聚集。而白细胞、单核细胞向血管内皮下迁移是AS早期最重要的始动环节。研究表明，在AS的早期病灶中已有Lkn-1的表达，而且这种表达受病理生理状态、代谢产物、氧化应激等多因素的影响。

Ox-LDL是致AS的独立危险因素，它可通过多重途径参与动脉粥样硬化的发生发展过程，ox-LDL引起内皮功能障碍，启动AS始动环节［6］;趋化单核细胞并诱导泡沫细胞形成;诱导平滑肌细胞增殖和凋亡;促进粥样斑块的破裂和血栓形成;诱导自身抗体与其形成循环免疫复合物。不仅如此，它还可作为炎症反应过程中潜在的诱导剂，正向调节AS中主要细胞表达一些炎性因子，如 C-反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6(IL-6)等［7］。由于生物连锁反应，这些因子又可刺激炎细胞分泌更多炎症因子，形成正反馈级联放大炎症反应，加速AS的发展，导致心血管不良事件的发生。本实验中用浓度为100 mg/L的ox-LDL作用于培养的巨噬细胞24 h后发现ox-LDL组较对照组Lkn-1的表达明显增加。进一步证明ox-LDL可发挥类似于前炎症介质的作用，刺激炎性因子的表达。这是其致AS形成的重要机制之一。

Lkn-1是新发现的炎性细胞因子，在炎性反应中起着重要作用［8］，表现为趋化单核细胞迁移至内皮下，诱导其他炎性因子表达和分泌，加速血栓的形成。有研究表现:Lkn-1具有诱导炎细胞表达和分泌炎性因子的作用。Lee等［9］应用Lkn-1处理人单核细胞白血病(THP-1)细胞株15 min，即可上调与AS斑块形成有关的炎症因子IL-8、MCP-1和TNF-αmRNA的表达。这些细胞因子在AS的多个环节中分别发挥生物学效应，进一步激活炎细胞。这样炎性介质与炎细胞之间形成一正反馈通路，级联放大炎性反应，推进AS的发展。本实验证明在泡沫细胞中有大量炎性因子Lkn-1表达，说明Lkn-1参与动脉粥样硬化过程。

他汀类药物可有效降低低密度脂蛋白水平，对炎性反应具有抑制作用，可减少巨噬细胞等炎性细胞因子表达。本研究用ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞，不同浓度阿托伐他汀干预后，与正常对照组相比，Lkn-1表达减少，且与阿托伐他汀的剂量有浓度依赖关系。阿托伐他汀可通过抑制ox-LDL诱导U937细胞形成泡沫细胞过程中Lkn-1的表达，发挥稳定粥样斑块和抗炎作用，其抗AS作用可能是通过抑制炎性因子的释放，减轻炎性反应实现的，但其通过何种信号通路减少炎性因子的释放还有待进一步研究。

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5 王娟，赵龙吟.动脉粥样硬化过程中的炎症反应.中国分子心脏病学杂志，2004，4:240-242.

6 何玉萍，匡忠生，何玉珊，等.氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞及促进血管平滑肌细胞增殖的机制.中国老年学杂志，2013，4:837-839.

7 Zhang YC，Wei JJ，Wang F，et al.Elevated levels of oxidized low-density lipoprptein correlate positively with C-reactive protein in patients with acute coronary syndrome.Cell Biochem Biophys，2012，62:365-372.

8 徐丽，凌文华.Leukotactin-1与动脉粥样硬化.岭南急诊医学杂志，2006，11:160-161.

9 Lee WH，Kim SH，Jeong EM，et al.A novel chemokine，Leukotactin-1，induces chemotaxis，pro-atherogenic cytokines，and tissue factor expression in atherosclerosis.Atherosclerosis，2002，161:255-260.