鹿茸多肽对缺血动物模型心肌细胞线粒体凋亡相关基因蛋白Bcl-2/Bax的影响

赵天一,姜彤伟,张永和

（长春中医药大学,吉林长春 130117）

鹿茸是名贵的动物药,多肽中含有多肽、多糖、生长因子等多种成分,近年来,有研究[1]显示,鹿茸多肽对心肌缺血有保护作用,能减少心肌缺血面积,调节心肌细胞膜和微粒体膜的稳定性,避免钙离子内流引起细胞超负荷,以减轻心肌细胞损伤。但其对是否抑制细胞凋亡并不清楚。心肌梗死和急性心肌缺血等疾病与心肌的细胞凋亡有关[2],本实验通过观察鹿茸多肽对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白的影响,探讨其对心肌缺血大鼠的保护作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠,体质量（220±20）g,60只,雌雄各半,由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供,合格证号为:SCXK（吉）2011-0004。

1.2 实验试剂 鹿茸多肽（分子量3 000 Da-10 000 Da）冻干粉,由长春中医药大学研发中心提供,批号:20120302。维生素C丸,由东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产,批号:120301。注射用青霉素钠,由华北制药股份有限公司,批号为X1112413。Bcl-2和Bax蛋白酶联免疫试剂盒由南京建成科技有限公司出品,批号为:20120603。

1.3 实验仪器 FSH-2A型可调高速匀浆机为江苏省金坛县望华科教仪器厂出品,BIO RAD-680型酶标仪由日本出品及德国Biofuge stratos型台式高速冷冻离心机。

2 实验方法

2.1 动物模型的复制 大鼠以乙醚吸入式麻醉,胸部备皮去毛消毒,围绕正中线做荷包缝合,正中线作约2 cm长的纵向切口,钝性分离胸大肌,暴露胸骨、肋骨,用小拉钩将4、5肋间分开,完全暴露心脏,剥脱心包膜,以左心耳与动脉圆锥之间的静脉为标志,将左冠状动脉前降支用缝合线结扎,心脏放回胸腔,挤出空气,逐层关闭胸腔,缝合外皮,等待苏醒[3]。假手术组动物未结扎左冠状动脉前降支,其余手术步骤与模型组相同,其它各组与模型组手术相同。手术后连续3 d内腹腔注射青霉素注射液。造模后第2天,选造模成功的大鼠,雌、雄各随机分为 6组,假手术组,模型组,维生素C对照组,鹿茸多肽高、中、低剂量组各10只。

2.2 给药 灌胃给药21 d,给药体积为1 mL/100 g,鹿茸多肽高、中、低剂量组剂量分别是0.016、0.008、0.004 g/kg,维生素C阳性对照组给药剂量为0.043 g/kg,假手术组、模型组给予同体积的蒸馏水。

2.3 心肌细胞线粒体相关蛋白的提取 灌胃给药第21 d,给药后1 h,以20%乌来糖注射液腹腔注射麻醉,给药剂量为1 mL/100 g。取下心脏,用生理盐水冲洗,剔除心房及右心室,留下左心室,取心尖组织200～300 mg,生理盐水冲洗,用滤纸吸去水分,剪碎,称取200 mg,加4℃生理盐水至2 mL（心肌组织含量为10%）,在冰浴4℃条件下,用高速匀浆机以1.5～1.6万r/min匀浆,每次10 s,间隔30 s,分5次;离心（2 000 r/min,10 min,4 ℃）,取出上 清;离 心（10 000 r/min,15 min,4 ℃）,去上清,取沉淀;称重,加4℃生理盐水（沉淀含量为 10%）,以1.5～1.6万r/min匀浆,每次5 s,间隔10 s,分5次,分装备用。

2.4 Bcl-2和Bax基因表达检测 按试剂公司提供的试剂盒操作说明操作,测定心肌细胞线粒体中凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的含量。

3 实验结果

心肌细胞线粒体内凋亡相关Bcl-2、Bax蛋白表达结果显示,与假手术组比较,模型组的Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值降低（P<0.01）。与模型组比较,鹿茸多肽高剂量组和鹿茸多肽中剂量,心肌细胞线粒体中Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达减少（P<0.05,P<0.05）,Bcl-2/Bax比值高于模型组（P<0.01,P<0.01）,低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果提示,对心肌细胞损伤时细胞凋亡蛋白表达有调节作用,其作用可能通过调节抗凋亡蛋白因子（Bcl-2）和促凋亡因子（Bax）的表达水平,对心肌细胞损伤起一定的保护作用。结果见表1。

表1 心肌细胞线粒体中Bcl-2和Bax蛋白表达（±s,n=10） ng/mL

表1 心肌细胞线粒体中Bcl-2和Bax蛋白表达（±s,n=10） ng/mL

注:与假手术组相比,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。

组 别 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax比值假手术组 4.15±0.69 8.62±2.28 0.49±0.12模型组 3.42±0.63Δ 10.98±1.49Δ0.33±0.12ΔΔ维生素C阳性对照组 4.15±0.63#8.58±1.49#0.50±0.12##鹿茸多肽高剂量组 4.13±0.54#8.46±1.66#0.51±0.12##鹿茸多肽中剂量组 3.99±0.40#8.72±1.78#0.47±0.07##鹿茸多肽低剂量组 3.79±0.32 9.38±1.04 0.41±0.05

4 讨论

心脏活动消耗的大量能量来自于细胞内的线粒体的供能物质ATP,心肌细胞缺血首先累及是线粒体,引起心肌细胞能量代谢障碍。线粒体DNA作为唯一的核外遗传物质,在细胞能量代谢上起着重要的作用,由于缺乏组蛋白,蛋白编码区密集无内含子,加之与电子转运链相邻,线粒体DNA极易受到氧化应激的损伤,而导致细胞凋亡。Bcl-2家族在细胞凋亡过程中起着至关重要作用,Bcl-2家族基因所表达的蛋白也成为判断细胞凋亡程度的一个检测指标[4],Bax是一种重要的促凋亡蛋白,而Bcl-2作为抗凋亡蛋白,二者的表达水平受到相关基因的调控。其中,抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax在细胞内的含量,也成为判断细胞凋亡程度的关键。而Bcl-2/Bax比值与细胞是否凋亡也有关,比值增加细胞凋亡会受到抑制,比值降低细胞凋亡反而增多。

据研究显示[5],鹿茸多肽对心肌缺血大鼠有缓解作用,而其机制尚未清晰。本实验用生化检测法,对心肌缺血大鼠心肌细胞线粒体内的Bcl-2、Bax蛋白的表达进行了检测,结果显示,模型组大鼠的Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升,Bcl-2/Bax比值降低。与模型组比较,鹿茸多肽高、中剂量组心肌线粒体中Bcl-2蛋白的表达增强,Bax蛋白的表达减少,Bcl-2/Bax比值也明显增加,且具有统计学意义;鹿茸多肽低剂量组Bcl-2蛋白的表达增强,Bax蛋白的表达减少,Bcl-2/Bax比值增加,但不明显。表明鹿茸多肽对大鼠缺血心肌损伤具有上调Bcl-2蛋白表达,和下调Bax蛋白表达的作用,从而对心肌缺血而引起的心肌细胞凋亡有抑制作用,对于减轻心肌细胞损伤有积极的意义。

综上所述,鹿茸多肽对心肌细胞的保护作用机制可能与它通过抑制对线粒体中相关促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的含量调节,抑制凋亡过程的启动,从而对心肌细胞中的线粒体起保护作用,达到保护心肌细胞的目的。

[1]陈晓光,王岩等.鹿茸多肽对异丙肾上腺素诱发大鼠心肌损伤的保护作用[J].中药药理与临床,2009,25（2）,64-66.

[2]谢志泉.细胞凋亡与缺血性心脏病[J].心血管病学进展,1999,20（5）:279.

[3]施新猷.医学动物的实验方法[M].北京:人民卫生出版杜,1989:336.

[4]Cook SA,Sugden P H,Clerk A.Regulation of bcl-2 family Proteins during develoP ment and in resP onse to oxidative stress in cardiac myocytes[J].Circ Res,1999,85（10）:940-949.

[5]张永和,黄晓巍.鹿茸醇提物对心肌梗死模型大鼠心肌损伤的保护作用及对血浆内皮素含量的影响[J].中国中医药信息杂志,2007,14（1）:40-41.