人白细胞介素10 cDNA的克隆及其真核表达载体的构建

刘国平，于晶晶

白细胞介素10（interlekin-10，IL-10）是已知的细胞因子网络中为数不多的一种抑制性细胞因子，主要由Ⅱ型辅助T细胞分泌产生，具有重要的免疫调节功能和抗炎作用，其生物学效应在重症感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展和转归过程中发挥着重要的调节作用，已有的研究资料显示IL-10有望成为临床相关疾病治疗的新选择[1-3]。本文旨在利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞中克隆人IL-10的cDNA并构建其真核表达质粒，为进一步研究IL-10基因在细胞内的表达特征及其影响因素和探讨临床开展IL-10基因治疗相关疾病的安全性与可行性奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 总RNA分离试剂盒、RT-PCR试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒DNA提取与纯化试剂盒，Qiagen公司产品；大肠杆菌 JM109菌株、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶 XhoⅠ （C↓TCGAG）与BamHⅠ （G↓GATCC）、DNA相对分子量Maker，Promega公司产品；真核表达质粒载体 pcDNA4/HisMax A，Invitrogen公司产品；DMEM培养粉，Gibico公司产品；优级胎牛血清，TBD生物技术研究中心产品；淋巴细胞分离液，北京京科生物技术公司产品；引物合成由上海生工生物技术服务公司完成。其他试剂均为市售国产或进口分析纯级产品。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞的分离与培养 采用Ficoll密度梯度法分离人外周血单个核细胞，按2×106/L培养于含DMEM液的培养瓶内，其中含105 U/L青霉素，100 mg/L链霉素，100 ml/L胎牛血清，20 mg/L ConA，于 50 ml/L CO2、37℃培养 16 h[4]。

1.2.2 总RNA提取 将1.2.1中含单个核细胞的培养液倾入一无RNA酶、无菌的50 ml的离心管中，4℃，1500 r/min离心5 min，收集细胞，按总RNA分离试剂盒说明提取总RNA，取5 μl RNA进行5%琼脂糖凝胶电泳，于紫外透射光下观察18S、28S rRNA带，确定RNA提取效果。

1.2.3 IL-10 cDNA的合成及扩增、纯化 根据GeneBank中Human IL-10全长开放读框基因mRNA序列（NM 000572）设计引物，上游引物：5’-CTCGGATCCAAGGCATG CACAGCTCAGC-3’（包含起始密码子和5’修饰限制性内切酶BamHⅠ酶切位点），下游引物：5’-CTCCTCGAGCCTGA TGTCTCAGTTTCGTA-3’（包含终止密码子和5’修饰限制性内切酶XhoⅠ酶切位点）。以提取的总RNA为模板，RT-PCR一步法合成并扩增IL-10 cDNA。逆转录条件：50℃，30 min进行反转录，随即95℃灭活反转录酶15 min。PCR条件：起动 94℃、5 min，变性 94℃、1 min，退火 52℃、1 min，延伸72℃、1 min，以上共35个循环，72℃终末延伸10 min。5%琼脂糖凝胶电泳，分析鉴定RT-PCR产物并纯化回收。以上按试剂盒说明书进行操作

1.2.4 重组真核表达质粒的构建与鉴定分析 37℃下，限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ分别消化RT-PCR产物和质粒载体pcDNA4/HisMax A各4 h，消化产物分别进行1.5%琼脂糖凝胶电泳并纯化回收。16℃，T4DNA连接酶作用下反应16 h，构建真核表达质粒。转化感受态细胞JM109菌种，氨苄青霉素（50 μg/ml）LB平板常规筛选阳性重组体。接种LB培养基，过夜培养。4℃下，6000 g离心15 min，除净培养液。按质粒提取试剂盒使用说明纯化提取重组质粒载体。以重组质粒为模板进行PCR扩增，引物及反应条件同前，鉴定重组质粒的正确性。重组质粒分别进行BamHⅠ单酶切和 XhoⅠ+BamHⅠ双酶切分析。上海生物工程技术服务公司ABI PRISMTM310型测序仪对IL-10 cDNA序列测定分析。

2 结 果

2.1 PBMC中总RNA提取及测定 提取的PBMC总RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳，可见完整的28S和18S rRNA，条带清晰，显示组织中提取的总RNA完整，RNA无明显降解（图1）。紫外分光光度计测定，提取的总RNA OD260光密度值为0.0892，RNA 含 量 0.18 μg/μl，OD260/OD28=0.0892/0.0487 ≈1.83，以上结果表明RNA样品纯度满意。

2.2 RT-PCR结果 以PBMC总RNA为模板合成的cDNA第一链，进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，与DNA Marker比较，扩增产物的大小约为0.54 kb，与hIL-10基因大小相符合（图2）。

2.3 重组真核质粒限制性酶切分析结果 重组真核表达质粒经BamHⅠ+XhoⅠ双酶切，电泳可见大小约为5.3 kb和0.54 kb的2条带，分别与质粒载体pcDNA4/HisMax A和RT-PCR产物大小一致。BamHⅠ单酶切后，电泳可见一条带大小约为5.8 kb。同时以重组真核表达质粒为模板进行PCR扩增，其产物与从PBMC总RNA经RT-PCR克隆获得的hIL-10片段大小相符。以上均表明重组克隆成功，hIL-10基因完整插入质粒载体pcDNA4/HisMax A中（图3）。

2.4 DNA序列测定结果 PCR产物经纯化回收，限制性内切酶消化产生粘性末端后，定向克隆入质粒载体pcDNA 4HisMax A，重组质粒进行DNA测序，结果证实克隆的hIL-10基因与GeneBank中所报道的hIL-10基因序列一致，表明重组质粒载体克隆成功。

图1 PBMC中提取总RNA琼脂糖电泳结果

图2 RT-PCR产物琼脂糖电泳结果

图3 重组真核表达质粒酶切电泳分析

3 讨 论

白细胞介素-10是1989年Fiorentino等首先发现的，因其有抑制多种细胞因子合成的功能曾被称之为细胞因子合成抑制因子，主要由Th2细胞产生[5]。人IL-10基因定位于第1号染色体的1q31～1q32区域，为单拷贝基因，整个基因含有3.5 kb，其转录生成的mRNA为含1.8 kb的核苷酸序列，其互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列中含有一个编码178个氨基酸的开放读码框架，但在一般的情况下表达水平低下，只有在某些特殊情况下或细胞受刺激后才出现高水平的表达。已有的研究表明，IL-10的生物学功能主要是[6-10]：①抑制单核细胞依赖性Th细胞的增生，同时抑制Th1细胞类细胞因子如 IL-1、IL-2、INF-γ、TNF-α 等的合成及活性； ②抑制单核细胞表面MHCⅡ抗原分子HLA-DR/DP及DQ的表达，降低抗原提呈细胞的抗原提呈能力，阻断抗原特异性的单核、巨噬细胞因子；③通过抑抑制INF-γ的产生抑NK细胞的活性。这些生物学作用符合了临床部分疾病如重症感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的治疗需要。

基因治疗是指将外源基因（目的基因），通过一定载体导入靶细胞（受体细胞），以补偿靶细胞的基因缺陷或蛋白分泌水平，或转基因的蛋白产物封闭靶细胞某种受体，使靶细胞获得新的生物学行为或功能，从而达到治疗疾病的目的。获得目的基因，是实施基因治疗从而达到治疗疾病目的的一项重要步骤。目前，获得目的基因的主要方法有：①真接从生物体基因组中机械剪切（超声）或内切酶酶解后分离出目的基因；②提取组织中的mRNA，以其为模板，通过反转录酶合成与mRNA互补的cDNA；③人工体外合成；④利用PCR技术扩增特定的基因片段。通过mRNA逆转录合成cDNA的方法，不但可以获得较为完整的连续编码顺序，且容易在宿主中实现目的基因的表达[11]。

根据质粒载体pcDNA4/HisMaxA和目的片段cRNA序列酶切位点特征，分别在上游引物5，端加入BamHⅠ酶切位点，下游引物5，端加入XhoⅠ酶切位点。当目的基因与载体分别经上述二种酶双酶切后，便产生两个不同的粘性末端，使目的基因IL-10 cDNA片段与质粒载体在适当位点发生定向重组。此方法具有连接效率高、连接点保留原来酶切位点的特点，插入片段的方向唯一，从而保证了目的基因与表达载体连接的准确性。

本文实验中通过对人外周血单个核细胞的体外分离和培养，提取总RNA，采用RT-PCR方法进行基因扩增，获得目的片段后将其与质粒载体进行连接，经酶切鉴定和测序分析，所获得的片段基因序列与IL-10的序列一致，实现了IL-10基因克隆及重组真核表达质粒构建，为今后临床进一步研究IL-10基因治疗以及相关蛋白提纯、抗体制备奠定了基础。

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