鹅副粘病毒YF株的分离鉴定与生物学特性研究

舒秀伟，陈生雷，周 丽，刘艳霞，苗玉和，李学志

(辽宁益康生物股份有限公司，辽宁辽阳 111000)

鹅副粘病毒病(Goose Paramyxovirus Disease)是由禽副粘病毒Ⅰ型引起的一种烈性、高度接触性、致死性传染病。自1997年由王永坤和辛朝安两位教授报道该病发生以来，国内许多地区先后发现该病的发生和流行［1］。本病以呼吸困难、肿头、流泪、喜卧、下痢、脾脏和胰腺肿大、散布大小不一坏死灶、消化道黏膜出血、溃疡、坏死、结痂为主要特征［2］，各种年龄的鹅都可发生本病，雏鹅的发病率和死亡率最高可达100%，是危害我国养鹅业发展的重要传染性疾病。本实验室对2000年3月辽宁彰武某养鹅场采集的病死鹅的肝、脾、肺、脑等病料进行了病原分离与鉴定，并对分离毒的生物学特性进行研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 试验动物 SPF鸡和10日龄SPF鸡胚，由辽宁益康生物股份有限公司提供;非免疫鹅(HI≤1∶4)、鹅胚，由辽宁省畜牧科学研究院豁鹅原种场提供。

1．1．2 NDV 标准抗原和血清、AI(H9、H5)血清由辽宁益康生物股份有限公司研发中心提供。

1．1．3 康复鹅血清 由辽宁益康生物股份有限公司研发中心提供。

1．2 方法

1．2．1 病毒的分离 以无菌方法采取病死鹅的肝脏、脾脏、心血直接涂片，革兰氏染色后镜检。采集病死鹅的肝、脾、肺、脑组织进行研磨，加入双抗，将病料悬液4℃作用4 h后，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚(鸭胚)，0．2 mL/枚，弃去24 h 内死亡鸡胚(鸭胚)，将24～96 h死亡的鸡胚(鸭胚)置4℃过夜后无菌采集尿囊液，并观察鸡胚(鸭胚)病变情况，收集的尿囊液进行HA、HI测定。取尿囊液，送解放军军事医学科学院军事兽医研究所进行电镜观察。

1．2．2 病毒的血清学鉴定 将分离毒用灭菌生理盐水稀释至 105．0ELD50/0．1mL，分别与 10 倍稀释并经56℃30 min灭活的抗鹅副粘病毒高免血清、NDV阳性血清、AI(H9、H5)血清等量混合，在24～30℃中和1 h，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0．2mL，置37℃观察120 h，对照组接种生理盐水。记录鸡胚死亡情况，活胚取尿囊液，测定HA效价。

1．2．3 毒力测定

1．2．3．1 ELD50测定 将鹅副粘病毒尿囊液进行10倍系列稀释，选定 3 个稀释度即 10－7、10－8、10－9，将每个稀释度分别接种5枚10日龄SPF鸡胚和5枚10日龄非免疫鹅胚(CAM接种，0．1 mL/枚)，并设对照组接种生理盐水 0．1 mL/枚。37℃孵育120 h，弃去24 h内死亡的鸡胚，记录鸡胚死亡情况，用Reed－Muench法计算ELD50［3］。

1．2．3．2 最小致死量的平均致死时间(MDT)测定

用无菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液做10倍系列稀释，取 10－7、10－8、10－93 个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚和10日龄非免疫鹅胚，上午9点每个稀释度接种5个鸡胚或鹅胚，每胚尿囊内注射0．1 mL做记号A。下午3点每个稀释度分别接种5个鸡胚或鹅胚，做记号B。接种后，每日上午9点、下午3点，A、B组各照蛋1次，记录鸡胚或鹅胚死亡时间，计算最小致死量的平均死亡时间。并测定每胚血凝活性［4］。

1．2．3．3 脑内致病指数(ICPI)的测定 取1日龄SPF雏鸡10只和非免疫雏鹅(HI≤1∶4)10只，各脑内注射10－1稀释的新鲜含毒尿囊液0．05 mL。另取2只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0．05mL。接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡和雏鹅的情况，观察8 d，计算正常、发病、死亡鸡或鹅的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为 1，死亡为 2)累计总分数［4］。

其中，zi和zi′分别为像素i和i′的光谱测度；‖zi-zi′‖用以计算zi与zi′间的欧氏距离；σi为像素i的尺度参数.令zi={‖zi-zi″‖,i″Ni}且‖zi-zi″‖按增序排列，取σi=zi(#Ni / M)，为取整操作符，#为计算集合所含元素总数操作符，M[2,6]为指定整数[22]，控制σi的取值，可根据待分割影像选取不同的M值.

1．2．3．4 静脉致病指数(IVPI)的测定 取6周龄SPF鸡10只和非免疫鹅(HI≤1∶4)各10只，静脉接种10－1稀释的含毒尿囊液0．1 mL，另各取2只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察、记录接种鸡或鹅情况，观察10 d后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值(正常为0，发病为 1，麻痹为 2、死亡为3)累计总分数［4］。

1．2．4 动物回归试验 取10日龄鹅、30日龄SPF鸡各10只，取收集的鸡胚尿囊液，10倍稀释后每只肌肉注射0．1 mL。并各设5只空白对照。严格隔离饲养，观察接种后的发病和死亡情况，并从病死鹅和鸡中分离病毒。

1．2．5 分子生物学鉴定 根据国外发表的NDV的F基因序列设计一对引物，进行RT－PCR鉴定，预期目的片段大小1660 bp。引物序列如下:

上游引物P1:5’－AATATGGGCTCCAAACC－3’

下游引物P2:5’－ATGCTCTTGTGGTGGCT－3’

1．2．6 免疫原性测定 将鹅副粘病毒分离毒做10－4稀释，然后接种于10日龄SPF鸡胚，收获鸡胚尿囊液(HA≥27)，经0．1%甲醛灭活后，与白油以1∶1．5的比例混合，制成油乳苗。用10日龄SPF鸡和5日龄非免疫鹅(HI≤1∶4)各20只(微量法，按《中国兽药典》进行)，每只胸部肌肉注射灭活疫苗0．2 mL，21 d后连同对照鸡和鹅各10只，胸部肌肉注射105ELD50强毒，观察14 d。

2 结果

2．1 病毒的初步分离 以无菌方法采取病死鹅的肝脏、脾脏、心血直接涂片，革兰氏染色后镜检，未见致病菌。初次分离病毒时，病毒可直接适应鸭胚，但不能直接适应于鸡胚，需经一代或一代以上的鸭胚传代后才适应鸡胚。取适应鸡胚的病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊腔，0．1 mL/枚，鸡胚于48～60 h全部死亡，鸡胚胚体出现的病变与鸭胚基本一致。死亡鸡胚病变均为全身表面点状弥漫性出血，胚体明显矮小，体表和内脏严重出血(图1)。取胚液进行微量法HA试验，结果表明收集的尿囊液能凝集鸡红细胞，凝集价(HA)在27～29之间。而且该凝集作用能被NDV阳性血清和康复鹅血清所抑制，抑制价(HI)为29和27。而禽流感阳性血清(H5、H9)则不能抑制分离毒凝集红细胞的作用。

图1 接种后48 h死亡鸡胚病变

2．3 形态学观察结果 电镜下呈现典型的副粘病毒形态，大量大小不一的病毒粒子多数呈圆形，表面有密集的纤突结构，病毒粒子大小在50～200 nm之间。电镜照片见图2。

图2 鹅副粘病毒YF株电镜照片

2．4 血清学鉴定结果 NDV阳性血清和康复鹅血清能特异性中和分离毒，接种鸡胚未见死亡;而禽流感H9、H5标准血清中和组接种鸡胚则全部死亡，其尿囊液具有血凝性;生理盐水对照组则没有血凝性。

2．5 毒力测定结果 此毒株对鸡胚半数致死量可达 10－8．3/0．1mL，对鹅胚的半数致死量可达到10－8．7/0．1mL;对鸡胚最小致死量为 10－7稀释度，平均死亡时间为51．6 h，鹅胚最小致死量为10－7稀释度，平均死亡时间为68．6 h;对鸡的脑内致病指数(ICPI)为 1．75，鹅的脑内致病指数(ICPI)为1．70，对鸡的静脉致病指数(IVPI)为 1．68，鹅的静脉致病指数(IVPI)为1．72。

2．6 动物回归试验 将分离毒的鸡胚尿囊液10倍稀释后接种10日龄鹅、30日龄SPF鸡，接种后第2天和第3天全部发病，发病症状与病变与自然病例特征相似，至第14天观察结束时，均全部死亡。从病死的鹅和鸡中都分离到具有血凝性的病毒。

2．7 RT－PCR结果 以分离毒鸡胚尿囊液提取的总RNA为模版，进行RT－PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条1．7 kb左右的特异性条带，与预期的扩增片段大小相符，见图3。说明分离毒是与NDV相关的副粘病毒。

图3 分离毒RT-PCR扩增结果

2．8 免疫原性测定 免疫鸡和鹅均100%保护，对照鸡100%死亡;对照鹅100%发病，80%死亡。结果表明该分离毒具有良好的免疫原性，可激发SPF鸡、非免疫鹅产生保护性抗体。

3 小结与讨论

3．1 本试验应用SPF鸡胚从发病鹅群中分离到一株病毒，经HA和HI试验、血清中和试验、电镜观察、动物回归试验、RT－PCR鉴定等确认为鹅源副粘病毒，并命名为YF株。该病毒具有血凝活性，能使SPF鸡胚、非免疫鸭胚、鹅胚100%死亡。一般认为，鹅可以感染副粘病毒，但感染后一般只带毒和排毒，不使鹅致病。但国内学者先后分离到了能使鹅发病和致死的同类病毒［5－8］，本实验分离的病毒，通过人工感染SPF鸡和鹅，证实该分离株对鸡和鹅具有高度的致病性。

3．2 对分离株分别应用实验动物，SPF鸡和非免疫鹅(HI≤1∶4)进行了 MDT、ICPI和 IVPI等项生物学致病性测定，应用SPF鸡测定的结果，MDT为51．6h、ICPI为 1．75、IVPI为 1．68，应用非免疫鹅测定的结果，MDT 为 68．6h、ICPI为 1．70、IVPI为1．72，结果表明分离株对鹅的致病性指标与应用SPF鸡测定的指标具有一定的相关性。参照国际上规定的NDV毒力判定标准，该分离株为强毒，进一步证实所分离到的野毒属禽副粘病毒的成员，即鹅副粘病毒I型。

3．3 免疫原性试验表明，该病毒在实验动物鸡和鹅上都具有良好的免疫原性，并且具有很高的保护率。

［1］ 左玉柱．鹅源副粘病毒病［J］．山东家禽，2004，(4):27 －28．

［2］ 钱 晨，张建军．鹅副粘病毒感染的诊断［J］．安徽农业科学，2007，35(36):11837．

［3］ 殷 震，刘景华．动物病毒学［M］．第2版．北京:科学出版社，1997．

［4］ 中华人民共和国农业部．中华人民共和国兽用生物制品质量标准［M］．北京:中国农业出版社，2001:316－318．

［5］ 辛朝安，任 涛，罗开健，等．疑似鹅副粘病毒感染诊断初报［J］．养禽与禽病防治，1997，1:5．

［6］ 周继宏，田慧芳，王永坤，等．鹅副粘病毒感染鸡试验［J］．中国预防兽医学报，2000，22(1):3 －4．

［7］ 周继宏，田慧芳，王永坤，等．鹅副粘病毒的人工感染试验［J］．中国预防兽医学报，1999，21(1):51 －52．

［8］ 黄淑坚，白挨泉．鹅副粘病毒病病原的分离及初步鉴定［J］．中国兽医杂志，2000，26(3):20 －21．