应用于兽用疫苗研发的病毒载体研究进展

毛娅卿，王 嘉，王 哲，吴 涛

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

随着分子生物学技术的发展和应用，疫苗的研制和开发取得了快速的发展。以重组病毒作为基因工程活载体疫苗，可同时启动机体细胞免疫和体液免疫，避免了灭活疫苗的缺陷，又无常规疫苗毒力返强之虞，尤为重要的是可以同时构成多价乃至多联疫苗，使之成为近几年来新型疫苗研制最为活跃也是最有希望的发展方向。然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于机体。原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来，只有少数几种DNA病毒及RNA病毒被成功地改造成为基因转移载体［1］并开展了不同程度的应用。

1 DNA病毒载体

1．1 痘病毒载体 痘病毒科是一大群、专性的病毒，感染的痘病毒病毒粒子形状呈砖形，直径300～400 nm，基因组由130～300 kb的单线双链DNA分子组成。

痘病毒在病毒学、免疫学和疫苗学等方面发挥着十分重要的作用。1789年，Dr．Edward Jenner证明牛痘病毒可以用于人类的免疫接种，预防天花的感染，这一发现奠定了免疫学的基础，同时也为实施全球性的免疫接种，并最终为从地球上消灭天花奠定了基础。后来，牛痘病毒被痘苗病毒(vaccinia virus，VV)所取代。1980年，世界卫生组织宣布人类消灭了天花，建议不再进行天花的疫苗接种。在过去的20多年中科学工作者做出了不懈的努力以改进重组病毒的安全性，这种改进措施包括两个方面，一方面是通过基因工程手段对VV进行致弱，另一方面是用禽痘病毒载体作为替代，构建安全高效表达外源基因的非复制型载体。目前，在基因的表达、疾病治疗和疫苗开发方面，禽痘病毒已经成了使用最为广泛的表达载体，在禽类疾病新型疫苗的研制方面得到了很好的应用。这些年，痘病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用见表1。

表1 痘病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用［2-5］

1．2 疱疹病毒载体 疱疹病毒科分为4个亚科:疱疹病毒甲亚科、疱疹病毒乙亚科、疱疹病毒丙亚科及未定名亚科。同痘病毒一样，疱疹病毒的基因组较大，约150 kb，可容纳多个外源基因的插入。

大多数疱疹病毒(伪狂犬病毒除外)的宿主范围很窄，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果。许多疱疹病毒经黏膜途径感染，构建的活载体疫苗可经黏膜途径提呈抗原，诱导特异性黏膜免疫。疱疹病毒活载体主要包括单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、I型牛疱疹病毒、河马疱疹病毒I型。其中，伪狂犬病毒活载体疫苗是病毒基因工程研究中比较活跃的领域，I型牛疱疹病毒活载体疫苗也有诸多相关报道。这些年，疱疹病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用见表2。

表2 疱疹病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用［6-7］

1．3 腺病毒载体 腺病毒属于腺病毒科，根据宿主范围不同，将腺病毒分为哺乳动物腺病毒和禽类腺病毒两个属。

腺病毒载体能高效表达外源基因，并能对外源蛋白进行剪切、糖基化、磷酸化等反应后加工，表达的蛋白具有天然蛋白的特性，可用于制药、基因工程疫苗、基因治疗以及肿瘤治疗等领域，已展现出良好的应用前景。重组腺病毒可以通过注射、口服、气管接种等途径进行免疫，接种动物不仅产生体液免疫和细胞免疫，而且还可以产生局部黏膜免疫应答，对预防呼吸道、消化道的感染具有极其重要的意义。这些年，腺病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用见表3。

1．4 杆状病毒载体 昆虫杆状病毒研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒和家蚕核型多角体病毒，用来表达外源蛋白也多用这两种杆状病毒载体。

表3 腺病毒载体在兽用疫苗研发方面的应用［8-9］

杆状病毒表达载体是一种辅助性依赖的真核DNA表达载体，已有近千种外源基因在杆状病毒表达系统得到表达。Wang SP等构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰的ORF5和ORF6双基因共表达的重组假型杆状病毒疫苗，小鼠免疫试验证实，重组病毒所诱导的IFN－γ水平和中和抗体水平均明显高于常规DNA疫苗免疫组［10］。余光清等也用该系统构建了表达日本血吸虫的谷胱甘肽S－转移酶(GST)的重组DNA疫苗，也获得了较好的免疫保护力。除此之外，重组杆状病毒表达伪狂犬病毒糖蛋白、流感病毒血凝素、兔病毒性出血症病毒VP60蛋白等的DNA疫苗也获得了较好的免疫效果［11－12］，表明重组杆状病毒 DNA疫苗是一种具有良好发展前景的疫苗载体。

2 RNA病毒载体

2．1 副粘病毒载体 副粘病毒成多形性，直径150 nm或更大，有包膜。病毒粒内含呈螺旋对称的核壳，核酸是一条连续的单链RNA长分子。

随着反向遗传学操作技术的发展，越来越多的RNA病毒成为病毒载体的研究对象，副粘病毒科中的新城疫病毒(NDV)的研究相对比较成熟，其基因组结构、分子特性及其相关性质了解的比较透彻，应用研究的也比较多［13］。Nakaya T［14］等在NDV Hitchner B1株P和M基因之间分别插入了CAT报告基因和流感病毒的HA基因，小鼠体内试验能抵抗致死剂量的流感病毒的攻击，说明NDV作为疫苗载体是非常有效的。Ge JY等在NDV P和M基因之间分别插入高致病性禽流感(HPAIV)的野毒株和变异株的HA基因，在活体试验中均能抵抗致死剂量的NDV和AIV的攻击，说明用NDV载体做二联苗是非常有前景的。

NDV载体作为一种重要的分子生物学工具，不仅在疫苗研究方面具有不可替代的地位，而且作为基因治疗载体的研究也日益进展。虽然NDV抗肿瘤的确切的机制尚未完全阐明，但随着基础医学和分子病毒学的发展，NDV作为一种有效的病毒载体具有广阔的应用前景是毋庸置疑的。

2．2 弹状病毒载体 弹状病毒粒是形态似棒状或子弹状的一科。病毒粒的大小为(130～380)nm×70 nm，核心为螺旋对称的核壳，内含连续线型单负链 RNA，分子量为(3．5 ～4．6)×106。

其中的水疱性口炎病毒(vesivularstomatitis virus，VSV)载体已被开发成为一种有效的治疗制剂［15］。VSV病毒载体是一种高效的溶瘤病毒载体，具有非常广的溶瘤范围。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体，VSV作为疫苗载体应用到获得性免疫综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。

2．3 甲病毒载体 甲病毒属于披膜病毒科，包括辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等30个成员。

甲病毒是一类能在宿主细胞的胞质内大量复制的RNA病毒。用外源基因替换结构蛋白基因的甲病毒载体，仍具有甲病毒的宿主感染谱广泛、能够自我复制、诱导被转染细胞发生凋亡等众多生物学特性，同时能够大量表达外源基因，激发机体产生高效的免疫反应，并不易与宿主基因组整合［16］。利用甲病毒的生物学特性，改造出相应的甲病毒载体，已被广泛地应用于基因治疗和分子生物学研究领域。1996年，Invitrogen公司率先推出了商品化的甲病毒载体［17］。

2．4 冠状病毒载体 冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60～220 nm。其核酸为非节段单链(+)RNA，长27～31 kd，是 RNA病毒中最长的RNA核酸链。

目前已经开发出了两类基于冠状病毒的表达载体，即辅助病毒依赖的表达载体系统和单基因组表达载体系统。通过对冠状病毒感染性cDNA进行改造可以获得外源基因的高效、稳定表达［18］。此外，冠状病毒载体以下几个特征使其成为非常具有吸引力的载体:①通过删除非结构基因、组织特异性基因可以将冠状病毒转化为无毒力的病毒;②通过对S蛋白的改造可以改变冠状病毒的组织和物种嗜性，从而将外源基因定向表达到不同的组织器官或物种。因此，冠状病毒对于疫苗开发以及基因治疗是前景非常好的载体。

2．5 反转录病毒载体 反转录病毒科的病毒特征为其基因组是双股(+)RNA，具有二十面体对称核心，内含核醣蛋白，外有包膜。

反转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统［19］，由反转录病毒载体、包膜蛋白载体和包装细胞系组成。反转录病毒载体具有基因组结构简单，便于基因操作、转染效率高、容量较大、宿主范围广、易于分离等优点，在外源基因表达、基因治疗、转基因研究、生物制药等方面应用广泛。

2．6 黄病毒载体 黄病毒属是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。在我国，主要的黄病毒成员有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和登革病毒。

目前所有黄病毒载体疫苗的研发均处于临床前阶段，而与其异常相近的黄病毒嵌合疫苗却发展得更为迅速。黄病毒嵌合疫苗［20］，是以一种黄病毒的结构基因替代另一种黄病毒的相同基因而获得的疫苗。由于外源基因和载体病毒之间的种间差异小，替代的基因具有类似的功能，所以嵌合疫苗的技术难度相对较低。与载体疫苗相比，嵌合疫苗技术只能用于预防性疫苗的研制，并且应用范围仅限于黄病毒预防疫苗。但这种技术与黄病毒载体技术极其类似，其应用经验可作为黄病毒载体技术的基础，因此，这种技术的迅猛发展也预示着黄病毒载体技术具有美好的发展前景。

3 病毒载体之比较

每种病毒载体都存在各自的优劣势，它们之间的比较见表4。

表4 各种病毒载体优劣势比较

续表

4 结语

目前，尽管病毒载体系统在研究和实验上取得了很大的进展，数个病毒载体已实现体内转基因的长时间表达，且多个病毒载体能同时启动机体细胞免疫和体液免疫，但病毒载体的安全性和靶向性问题还有待进一步的研究解决。研究表明通过使用组织特异性启动子或多聚物和脂质体的修饰，可提高基因转移的靶向性，且多聚物和脂质体的修饰还可减轻免疫反应，有利于载体的重复应用。针对有些病毒载体插入外源基因的能力较低、插入宿主基因组、多次免疫后机体产生针对载体部分的抗体、转基因生物释放等的劣势，可调控表达外源基因的病毒载体、靶向性载体、无病毒基因的病毒载体甚至是自我灭活或自我破坏的病毒载体应该是今后努力的目标。相信随着技术的进步，病毒载体系统会得到进一步完善提高，从而早日实现病毒活载体疫苗的产业化。

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