精神分裂症患者阿立哌唑血药浓度检测的相关性研究

完燕华，刘菊林，战春燕，任芳媛

阿立哌唑(Aripiprazole，Ari)是日本大冢制药公司(Otsuka公司)于1998年开发的第2代非典型性抗精神病药，商品名为Abilify，是一种多巴胺自身受体激动剂和5-羟色胺系统稳定剂，用于精神分裂症的治疗［1］。2002年美国食品和药物管理局(FDA)批准该药上市，2004年中国食品和药品监督管理局(SFDA)批准该药上市。阿立哌唑具有锥体外系反应低、疗效好、不良反应轻、耐受性好的优点［2］。国外多采用液相色谱－质谱，质谱(LC-MS/MS)法测定阿立哌唑在血浆中的浓度［3］，但其成本较高不便普及。为方便临床对阿立哌唑血药浓度的监测和药代动力学的研究需要，本试验参考国内外有关文献［4-5］，建立了一种以乙醚 +二氯甲烷为提取剂测定人体血浆中阿立哌唑浓度的反相高效液相法(RP-HPLC)，并将其成功运用于临床，以期为临床合理用药提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 高效液相色谱仪(北京科瑞海科学仪器有限公司)，UV3000可变波长紫外分光检测器(北京创新通恒科技有限公司)，7725i六通进样器、色谱工作站(北京创新通恒科技有限公司)，离心机、超声波发声器、DG55高效液相色谱系统在线脱气机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，柱温箱(天津旗美公司科技有限公司)，旋涡混合器，微量进样器 25 μl。

1.2 试剂与试药 色谱用甲醇、乙腈(天津科密欧化学试剂有限公司)、分析用二氯甲烷、乙醚、净化的超纯水、市售分析纯;阿立哌唑片(规格:10 mg/片，成都大西南制药公司)、阿立哌唑对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号:100776-200501，纯度99．8%)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱 C18(4．6 mm×250 mm，5 μm，迪马公司)，检测波长 257 nm，流动相为乙腈－甲醇，以冰醋酸 pH值调至 6．3，用前经0．45 μm微孔滤膜过滤并超声波脱气，流速1 ml/min，柱温 35℃，进样量 15 μl，量程为 0．02 全方位吸光度单位(AUFS)，外标法定量，阿立哌唑保留时间为5．567 min，样品测定不受干扰(图1)。

图1 阿立哌唑反相高效液相色谱图

2.2 对照品溶液配制 精密称取阿立哌唑对照品50 mg置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为储备液，浓度1 mg/ml，再将对照品储备液分别加甲醇稀释至 40、30、25、20、15、10、5、2．5 和1．25 μg/ml作为系列工作液，置4℃冰箱中保存，使用时用甲醇稀释至所需浓度。

2.3 标准曲线制备 取空白血浆0．9 ml分别加入阿立哌唑不同浓度的对照工作液适量，使血浆中阿立哌唑浓度分别为 5、25、50、100、200、300、600、800 ng/ml，然后加 2 mol/L NaOH 100 μl碱化混匀，加乙醚和二氯甲烷共3 ml，涡旋混合4 min，然后以转速3000 r/min离心10 min。准确吸取乙醚、二氯甲烷层移入另一离心管中，于50～60℃水浴中氮气流下吹干，残留物以甲醇80 μl充分复溶混匀，高速离心后取15 μl进样分析。以峰面积X对应其浓度Y，进行线性回归，得回归方程为Y=268．3X+30．2(r=0．9967)。结果显示，阿立哌唑在5～800 ng/ml范围内线性关系良好，最低检测浓度为5 ng/ml。

2.4 精密度和方法回收率 配制含阿立哌唑高、中、低3种不同浓度的血浆样本各5份，按“2．3”项下方法处理，分别做日内及日间试验，计算日内及日间的精密度(RSD)和方法回收率，见表1。

表1 精神分裂症患者血浆阿立哌唑精密度和回收率试验结果

2.5 重复性试验 取空白血浆配制的含300 ng/ml样品 1．0 ml，按“2．3”项下方法处理，测定阿立哌唑浓度，重复进样5次，含量的RSD=1．96%，说明本法的重复性良好。

2.6 干扰试验 为了确保血样测定的可靠性，对临床常用的抗精神病药物分别配制成50和300 ng/ml的溶液，上述色谱条件下进样15 μl，进行色谱分析，结果:氯氮平保留时间12．966 min，利培酮保留时间8．906 min，奋乃静保留时间 13．546 min，对阿立哌唑均无明显干扰。

2.7 血药浓度检测

2.7.1 诊断标准:本实验室自2011年12月建立本方法以来，检测阿立哌唑血药浓度样本34例，患者诊断均符合中国精神疾病分类方案和诊断标准第3版(CCMD-3)精神分裂症诊断标准［6］。均为长期服药者，其中男20例，平均年龄(38±15)岁;女14例，平均年龄(27±12)岁;病程(11±6)个月。血、尿常规及肝肾功能等实验室检查正常，无严重器质性疾病。

2.7.2 服药剂量:口服1次10～15 mg，2/d，服药期间均未服用其他抗精神分裂症药物。

2.7.3 采血时间:于服药2周后晨时采集静脉血5．0 ml，分离血浆，按“2．3”项下方法处理样本并进行测定。

2.7.4 血药浓度测定结果:测得患者阿立哌唑平均血药浓度为(371．2 ±36．6)ng/ml。

2.8 灵敏度 当信噪比≥2(S/N≥2)时，阿立哌唑的最低检出量为5 ng/ml，可满足监测要求。

3 讨论

本研究建立了测定阿立哌唑血药浓度的RPHPLC法。在选择测定波长时，因阿立哌唑结构中含有2个苯环，具有共轭体系，故有明显的紫外吸收。本试验以甲醇为空白，在200～300 nm波长范围内对阿立哌唑对照液进行最大吸收波长紫外扫描，发现在220 nm和257 nm处均有最大吸收峰，但220 nm接近与末端吸收，噪声较大，257 nm波长处吸收更灵敏，吸收值更大，故选择257 nm作为测定波长，试验结果稳定可靠。另外，因阿立哌唑在甲醇中溶解度较小，为了增加阿立哌唑的溶解度，在配制浓度较大的储备液时加醋酸溶液0．5 ml［7］。

在流动相选择上，先以甲醇－水－乙腈作为流动相，通过对流动相中各成分不同配比研究发现，为使阿立哌唑缩短保留时间，峰形良好，达到好的分离效果，对流动相不同成分之间的配比进行了改进，将甲醇－水－乙腈系统改为甲醇－乙腈系统，并适量加入正丁胺和冰醋酸调节pH值。本研究发现，在流动相pH值为6．3时，阿立哌唑分离良好，兼顾保留时间、分离度及峰形，故选择流动相中的甲醇为59．5%。

样品制备方面，阿立哌唑在碱性条件下才能被有机溶剂萃取，所以在样品预处理中加入强碱(0．1 mol/L的 NaOH)，以使信号稳定，利于测定。试验中曾单用乙醚进行萃取，发现萃取率较低。阿立哌唑易溶于二氯甲烷［8］，故使用乙醚+二氯甲烷(80∶20)进行混合萃取，萃取率高，重现性好，且复溶后所含杂质较少，不影响测定。

RSD日间试验发现各批次样本保留时间稍有差异，但均在保留时间的±1．1%以内，RSD均在允许范围的±5%以内［9］，此漂移差异可能由于流动相组分、柱温及启动分析时间等的轻微变化所致。

阿立哌唑口服吸收迅速，3～5 h达到最高血药浓度(Cmax)，食物不影响阿立哌唑最高血药浓度［10］。在2～30 mg的剂量范围内，阿立哌唑的血药浓度与剂量呈线性关系［11］。本研究结果显示，口服阿立哌唑片的药代动力学特点符合二房室模型，被测患者阿立哌唑的平均血药浓度为(371．2±36.6)ng/ml，与张国阳等［8］的研究结果基本一致。本研究方法样品预处理过程较简单，干扰少，色谱保留时间短，缩短了分析时间，节约了流动相，灵敏度高。该方法灵敏、准确、专一性强，可满足临床进行治疗时药物监测和药效学研究的要求。

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