小鼠血管内皮细胞的培养、鉴定及巨噬细胞移动抑制因子对其促增殖作用的研究

段朝霞，陈魁君，张洁元，李兵仓，王建民

血管内皮细胞(VEC)由一层扁平细胞所组成，呈单层连续性衬在血管内面，形成血管的内壁。在炎症反应、损伤及免疫应答等多种病理生理过程中发挥作用。VEC功能的异常与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病、免疫疾病及肿瘤扩散都有密切关系［1］。为了对内皮细胞的功能有更多了解，研究者不断地对人及动物内皮细胞的原代培养方法进行探索。本文参照文献报道的培养方法［2-3］，探索简单易行的小鼠VEC的培养及鉴定方法，并研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对VEC增殖活性的影响，为深入研究VEC的相关作用机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 实验动物为清洁级6～8周龄C57B6小鼠5只，雌雄不限，体质量18～25 g。由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂及仪器 高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)为 Gibco产品，内皮细胞生长添加剂(ECGS)为 Sigma公司产品，大鼠抗小鼠 CD31/CD144抗体为BD公司产品，基质胶(MatrigelMatrix)购于BD公司，大鼠抗小鼠CD146免疫磁珠、MPC-S型磁架为Dynal公司产品，胰酶为Invitrogen产品，小鼠重组 MIF及抑制剂［(S，R)-3-4-羟苯-4，5-二氢-5-异口恶唑乙酸甲酯］(ISO-1)为 Sigma公司产品，甲基噻唑基四唑(MTT)试剂盒为Sigma公司产品。倒置相差显微镜(Olympus)、荧光显微镜(Leica)、酶标仪(Thermo labsysytems)。

1.3 方法

1.3.1 抗体磁珠的预处理:首先将50 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于50 ml磷酸缓冲液(PBS)中制成0.1%BSA/PBS的磁珠冲洗缓冲液，用0．22 μm 滤器无菌处理后4℃保存;在超净工作台内取100 μl抗CD146免疫磁珠于1 ml磁珠冲洗缓冲液，置于磁架上，1 min后移去上清液，重复冲洗4次;用磁珠冲洗缓冲液再悬浮磁珠至最初的容积，每100 μl磁珠加入10 μl(5 μg)抗体，置于旋转混匀机混匀，4℃孵育过夜或室温孵育2 h;于磁架上用磁珠冲洗缓冲液冲洗4次后，再用磁珠冲洗缓冲液再悬浮磁珠抗体至最初的容积，于4℃条件下可保存1个月。

1.3.2 细胞的制备:实验前1天将基质胶放入4℃条件下过夜，使其溶化;加入血管环之前15 min，在12孔板内加入1．0 ml基质胶(保证底部铺满即可)，放入37℃培养箱内使其凝固。用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉小鼠后，用75%乙醇消毒5 min，无菌条件下打开腹腔和胸腔，游离主动脉，取髂总动脉分支平面到降主动脉段的动脉，置于装有冰D-Hanks液的一次性组织培养皿内，用无菌注射器吸取D-Hanks液冲洗血管环;然后将血管环移入另一个装有冰D-Hanks液的一次性组织培养皿内，在解剖显微镜下剥去血管环周围的脂肪及结缔组织;再将分离的组织置于直径100 mm的一次性组织培养皿中。在解剖显微镜下将血管环剪成0．5 mm长短后放入预先加了基质胶的12孔培养板内，每孔放2或3节，孔内再加基质胶，覆盖血管环，放入37℃培养箱内15 min使其凝固，在培养孔内加入内皮细胞培养基(含 20%FBS、75 μg/ml ECGS，50 μg/ml肝素、200 U/ml青霉素、0．2 μg/ml链霉素的DMEM)。将培养板置于5%CO2、37℃培养箱中进行培养，待细胞长至80%～90%融合时，采用胰酶消化法进行传代培养。

1.3.3 单细胞悬液的制备:细胞达到80%～90%融合时进行胰酶消化收集细胞。吸掉培养基，以少许0．25%胰酶溶液润洗1遍，吸掉润洗液，加入0.25%胰酶溶液，完全盖住细胞即可，置于37℃培养箱中进行消化并计时，相差显微镜下观察消化状态，以细胞收缩变圆，细胞间有明显间隙为消化完全，轻轻拍打培养皿边沿使细胞分散开，立即加入3～4 ml含血清的培养液终止消化，混匀制成单细胞悬液，备纯化用。

1.3.4 免疫磁珠的分离:严格按照试剂盒说明书操作。每1 ml细胞悬液加入15 μl抗CD146免疫磁珠，置于旋转混匀机4℃孵育20 min;将EP管置于磁架2 min。吸附细胞的磁珠和无细胞吸附的磁珠将被分至EP管的两极;无需移动EP管，将上清液移出，从磁架上取下EP管，各加入1 ml冰基础培养基重悬磁珠团粒;将EP管再置于磁架上2 min，小心地吸出上清;重复冲洗至少4次，直至上清液变得清澈;各加入1 ml内皮细胞培养重悬磁珠团粒，收集纯化细胞计数并鉴定纯度，然后将其余细胞按104接种至0．1%明胶涂层的96孔板或10 cm培养皿内，加入适量的完全培养基;放入5%CO2培养箱孵育过夜，移除未贴壁细胞，已贴壁细胞用D-Hanks液冲洗2次后加入适量完全培养基;隔日换液。

1.3.5 细胞的鉴定:采用抗CD31抗体进行VEC的免疫组化鉴定，同时用Hoechst 33342标记细胞核。用摔片机将经抗CD146免疫磁珠纯化后的细胞集中在玻片上，每张玻片约1000个细胞，然后将细胞标本用新鲜配制的4%多聚甲醛固定10 min;PBS漂洗3次，每次5 min;用山羊血清或1%BSA室温下孵育30～60 min;加入大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体(1∶100)，4℃孵育过夜或37℃孵育3 h，PBS漂洗3次，每次5 min;加入PE标记的山兔抗大鼠IgG(1∶50)二抗混合工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;5 μg/ml的 Hoechst 33342工作液37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min;玻片自然干后，用封片剂封片，防止荧光淬灭;在荧光显微镜下随机选择9个视野，相应激发光下分别观察CD31抗体及Hoechst 33342染色结果。

1.3.6 细胞增殖的测定:用MTT试剂盒检测，严格按试剂盒说明书操作。将细胞按104/孔种植于96孔板，待细胞70%～80%融合时按是否加入不同浓度的MIF或MIF拮抗剂ISO-1，分为空白对照组(8孔)、MIF组(40孔)、ISO-1组(24孔)。继续培养48 h后，每孔加10 μl MTT试剂，轻轻混合均匀后，将培养板放于37℃条件下孵育3 h，孵育结束后，96孔板底部可见黑色颗粒状物质;轻轻吸掉上层液体，注意不要将黑色颗粒吸出;每孔加入100 μl颗粒溶解液，混匀后成用酶标仪在570 nm处测吸光度(OD)值。MIF 用 5、25、50、100、200 ng/ml 5 个浓度，ISO-1 用100、250、500 μmol/L 3 个梯度，每个浓度用8孔。

1.4 统计学处理 应用SPSS 11．0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 VEC形态 原代培养4～6 d，在动脉血管环附近可见少量的细胞迁出并贴壁生长，细胞呈短梭形或多角形，细胞边界清楚，体积较大，胞浆丰富，核呈椭圆形。培养9～14 d，迁移出的细胞覆盖培养孔面积的2/3以上，密度不匀，其中约80%的细胞汇合成多层，单层呈现内皮细胞典型的“鹅卵石”样特征。见图1。

图1 原代培养小鼠主动脉内皮细胞镜下形态(×100)

2.2 细胞鉴定 纯化细胞经免疫组化后在荧光显微镜下检测结果显示，细胞纯度均在95%以上，见图2。由于未经过培养的细胞直接用摔片机摔到玻片上的，因此免疫组化结果显示无明显的细胞形态。

图2 荧光显微镜下小鼠主动脉内皮细胞CD31(免疫荧光染色 ×100)

2.3 MIF对VEC增殖的影响 低剂量MIF能显著促进VEC的增殖，并具有剂量效应关系，而高剂量MIF及MIF的抑制剂ISO-1能显著抑制VEC的增殖，ISO-1的抑制增殖作用也具有剂量效应关系。见表1。

表1 不同浓度MIF及ISO-1促进主动脉VEC增殖的情况

3 讨论

国内外开展VEC的原代培养已多年，方法主要有组织块贴壁法和酶消化法;鉴定方法多用细胞形态学结合免疫组化染色AgⅧ相关抗原、流式细胞仪检测CD31表达等［4-7］。上述2种VEC原代培养方法虽然步骤简单、经济易行，但是存在成纤维细胞等杂细胞干扰的缺点，即便使用差速贴壁和分次消化的方法也不能完全去除杂细胞，从而使其实用性受限。本实验选择酶消化法结合免疫磁珠法分选，并结合实验室的条件，反复摸索，在国内外文献报道的VEC培养方法上加以改进，可快速、简便地分离、纯化、体外培养和鉴定小鼠VEC。结果显示，成功分离并体外扩增出小鼠VEC，克服了杂细胞的干扰。实验成功的关键在于:抗体磁珠预处理时充分清洗(不少于4次)，尽量去除叠氮钠(NaN3)以减少其对细胞的不良影响;取动脉环及分离时尽量在冰DHanks液中操作，以保证细胞的活性;胰酶消化时，最好每隔几分钟放于显微镜下观察一次，完全消化后及时终止消化，一般总消化时间不能超过20 min，以免损伤细胞影响贴壁;抗体与磁珠作用及细胞与抗体磁珠作用时保持4℃环境，以确保抗体活性，并降低细胞代谢，从而保证分选效率和细胞活性。

MIF从被发现至今已40多年，研究者对它的认识逐渐全面、深刻。MIF作为淋巴细胞因子被发现并一度被认为只有活化的T淋巴细胞才能产生MIF，现在发现脑垂体前叶、单核(巨噬)细胞、表皮细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞、VEC和平滑肌细胞等也产生MIF［8］。MIF除作为淋巴细胞因子外，还是一种重要的促炎因子，能够对抗糖皮质激素的抗炎作用，调节细胞增殖、抑制细胞凋亡，是参与肿瘤形成和血管发生的重要因子［9-11］。经实验证明，天然MIF和重组MIF同样具有互变异构酶的活性。ISO-1为选择性MIF互变异构酶抑制剂的一种，通过特异性结合MIF的D型多巴色素互变异构酶活性位点，抑制该酶活性并阻止MIF结合其他细胞间信号转导分子，从而抑制MIF的功能活性［12］。大量研究证实，MIF能促进多种细胞如大肠癌细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞等的增殖;而MIF的抑制剂ISO-1可抑制这些细胞的增殖及相应的功能活性［13-16］。本研究初步证实，低剂量MIF可以促进VEC增殖，并具有剂量效应关系。高浓度MIF却不具有促进细胞增殖的作用，反而抑制细胞的增殖，这与其他文献报道的结果不一致。笔者查阅大量的文献，发现很少的文献做MIF促细胞增殖的量效关系研究，大多数直接采用低浓度(10 ng/ml)的MIF做增殖实验。有研究证实，MIF在50～100 ng/ml时的活性达到最佳［17］，与本实验结果一致高浓度MIF抑制细胞增殖的原因有待于进一步明确。

本研究结果初步证实，低浓度的MIF能促进原代培养的VEC增殖，说明MIF在血管发生及其他血管类病变中起重要作用，也可能通过促进血管生成来加强肿瘤的浸润转移，但其具体机制有待于进一步研究证实。

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