凝胶渗透色谱法测定植物油中没食子酸丙酯

蔡俊峰

（泉州市产品质量检验所，福建 泉州 362000）

没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）是一种常见的抗氧化剂[1]，在动植物油、坚果、面包、全脂奶粉、饲料和谷类食品等食品行业中有着广泛的应用。PG（没食子酸丙酯）通过形成稳定、低能量的抗氧化剂游离基，阻止油脂的氧化反应，延长了食品的保质期[2]。但是，过度添加PG会对人体健康产生危害，尤其是肾脏[3]。卫生部于2011年4月20日发布的《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2011）明确规定了食品中的PG最大添加量，在不同的食品种类中，PG的最大使用量也不相同。

目前，PG常见的检测方法有分光光度法[4]及液相色谱法[5，6]。国标GB/T5009.32-2003采用液液萃取的前处理手段提取油脂中PG，并通过分光光度法测定；进出口行业标准SN/T 1050-2002利用乙腈饱和的正己烷及正己烷饱和的乙腈提取油脂中PG，检测手段则是液相色谱法。但是，上述两份标准中所涉及到的样品预处理操作相对繁琐，且涉及到的大量人工操作易导致回收率的相对标准偏差增大。凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）是一种新型分离技术，也称为体积排除色谱或尺寸排除色谱。

文中以GPC为净化手段，结合高效液相色谱-二极管阵列检测器对油脂中PG定性定量检测，所建立的方法选择性好，灵敏度高，自动化水平高，能准确、快速地测定油脂中PG。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

PrepLinc GPC & AccuVap凝胶渗透色谱净化-真空浓缩系统（美国J2 Scientific公司），仪器带254nm紫外吸收装置，凝胶填料为Bio Beads S-X3 200-400目，填料质量50g，定量环为5mL；LC1200 series高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器（美国Agilent公司）。

乙酸乙酯，环己烷，甲醇皆为HPLC级，购自Tedia公司，实验用水来自超纯水机，电导率不低于18.2MΩ。PG标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于99%。

1.2 色谱条件

色谱柱为 CNW Athena C18-WP，100A，（4.6mm×150mm，5µm）；柱温：30℃；检测波长：275nm；扫描波长：210nm～400nm；进样量，10µL；流动相为甲醇。

1.3 样品前处理

准确称取0.5g植物油，加乙酸乙酯-环己烷（V：V，1：1）溶解，漩涡振荡并定容至10 mL。通过凝胶渗透色谱柱净化后在线浓缩，并用甲醇定容至1mL，经0.45µm滤膜过滤后，供液相色谱测定用。

1.4 标准溶液的配制

称取PG标准品（精确至0.1mg），用甲醇溶解并配制成1mg/mL的储备液，于-20℃冰箱中避光保存。用甲醇将该储备液逐级稀释为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/mL的标准工作液。标准工作液现用现配。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

样品运行前，须对全自动凝胶渗透色谱系统的洗脱条件进行选择。采用常用流速5.0 mL/min洗脱，以紫外检测器（紫外吸收波长254nm）检测油脂及PG的流出时间。分子量越大，流出时间越早，加上样品本身含有的大分子杂质较多，由紫外吸收谱图可知（图1），油脂以及一些大分子物质在15分钟内已基本分离洗脱完毕。为考察PG流出时间，以花生油为基质，采集15-24 min、15-27 min和15-30min三个不同时间段的洗脱液，各时间段PG回收率见表1。结果表明，采集时间段为15-24 min，PG的回收率小于50%，远达不到GB/T 27404-2008[7]的要求；采集时间段15-27min和15-30min下，PG的平均回收率分别为92.2%和92.7%，两者的回收率无显著差异。最终决定采用15-27min作为流动相收集时间。

图1 GPC流动相流速为5.0 mL/min时，花生油加标样品的紫外（吸收波长为254nm）吸收谱图

表1 PG在不同采集时间时的回收率（n=3）

2.2 液相色谱条件的选择

通常液相色谱推荐的流动相流速为1.0mL/min，经GPC净化后油脂仍含有一定量的杂质，流速过快导致目标物PG和其它未知组分无法完全分离；流速过慢导致检测时间长，目标物峰面积虽无明显变化，但峰形较矮，灵敏度较低。经多次试验选取流动相流速0.8mL/min，其分离效果和目标物的峰形都较为理想。该文同时还考察了柱温（20℃，25℃，30℃，35℃，40℃）对PG灵敏度的影响，结果表明，PG的峰面积随温度的升高或下降未出现明显变化，因此最终决定采用30℃作为使用温度。图2为PG在最优化色谱条件下的液相色谱图。

图2 PG在最优化色谱条件下的液相色谱图

二极管阵列检测器的优势在于其可以提供目标物在某一特定波长范围内的吸收光谱图，为目标物的定性提供了又一验证手段。因此，采集PG在210-400nm间的紫外吸收谱图（图3），从图中可知，PG的紫外吸收的最大值为275nm，此检测波长下PG可获得最大灵敏度。

图3 PG在210nm-400nm间的紫外吸收谱图

2.3 方法学验证

2.3.1 相关性试验

取PG的系列标准溶液，按所述操作并进样，记录峰面积。以峰面积Y为横坐标，浓度X为纵坐标，绘制线性曲线，并进行线性回归计算。结果显示，在给定的范围内目标物呈良好线性相关。该方法检出限以最低加标水平中目标组分的3倍平均信噪比对应的浓度为检出限（LOD），10倍平均信噪比对应的浓度为定量限（LOQ），平行测定3次，取平均值作为该方法的LOD及LOQ，结果见表2。从表2中可知，目标组分的LOD和LOQ均低于国家标准的限量值[8]。

表2 PG的线性范围、线性方程、线性相关吸收、LOD及LOQ

2.3.2 精密度试验

选用花生油、大豆油、芝麻油、茶籽油和调和油五种基质，添加PG标准溶液，按分析步骤，在20个工作日内，分6次进行重复提取和测定，计算回收率和日间精密度；另外，选择其中一天，测定6个平行样，计算回收率和日内精密度。在完成回收率试验的同时也做空白样品试验以得到各基质样品的背景值。在基质中，分别添加三个浓度水平的标准溶液，按给定方法平行测定6次，结果见表3。

表3 各基质加标回收试验结果（n = 6）

从表3中可以看出，不同油脂中目标组分PG的回收率在89.3%-104.1%，日内精密度在3.5%-8.1%，日间精密度在2.4%-9.6%，完全符合痕量物质的分析要求[7]。

3 小结

油脂经过乙酸乙酯-环己烷(1：1，V：V)溶解，在全自动凝胶渗透色谱洗脱上净化、浓缩、定容，净化液用高效液相色谱-二极管阵列检测器定量定性分析。试验表明此方法回收率高，精密度好，而且试验时间短，自动化程度高，完全满足PG日常检测的需要。

致谢

衷心感谢杨乙强所长（教授级高工）在此论文撰写工作中的帮助与指导。

[1]苏广健，李虹红.油脂中TBHQ、PG、OG、BHA和BHT的同时检测研究[J].食品现代科技，2010，10：1160-1163.

[2]李囡，姜子涛，李荣.食品中没食子酸丙酯的定量分析研究进展[J].食品研究与开发，2007，28（9）：172-175.

[3]段小娟, 蔡发, 牟志春, 王曼霞.高效液相色谱法同时测定植物油脂中9 种抗氧化剂[J].理化检验（化学分册），2010，46（5）：571-573.

[4]GB/T5009.32-2003.油脂中没食子酸丙酯（PG）的测定.

[5]SN/T 1050-2002.进出口油脂中抗氧化剂的测定液相色谱法.

[6]SN/T 1785-2006.进出口化妆品中没食子酸丙酯的测定液相色谱法.

[7]GBT 27404-2008.实验室质量控制规范 食品理化检测.

[8]GB2760-2011.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准.