补肾解毒方联合程序性死亡受体配体-1抗体对HBV转基因小鼠T细胞免疫应答影响的研究*

蔡本强 贺劲松 邢宇锋 马晓军

1.广州中医药大学深圳附属医院肝病科 (广东深圳，518033) 2.广东省人民医院广东省医学科学院感染科

慢性HBV感染时，树突状细胞、T细胞免疫功能低下，诱导产生强烈的HBV特异性CTL免疫应答，是乙肝疫苗研制的关键内容。在前期对补肾解毒方能调节T细胞的免疫功能及具有抑制HBV DNA作用研究基础上，本研究使用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1通路，并以补肾解毒方辅助免疫HBV转基因小鼠，观察其对小鼠CTL细胞免疫应答的影响，为寻找能有效抗HBV免疫方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 BALB/c HBV转基因小鼠，SPF级，雌雄不限，8～10周龄，20～30g，购自广州空军医院实验动物中心。HepG 2.2.15细胞为本室自行传代培养。

1.2 实验药物与试剂 补肾解毒方:由仙灵脾30g，菟丝子10g，杜仲、怀牛膝、枸杞子、枳壳、郁金、印度叶下珠各15g组成;文火煎煮，制成中药汤剂，使用时用药浓度为生药含量2.51g/ml。PD-L1单克隆抗体、对照抗体IgG2a购自美国eBioscience公司。PBS本室自行配制。HBsAg蛋白由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，重组小鼠IL-2为Peprotech公司产品。异硫氰酸荧光素 (FITC)标记的抗小鼠CD8单克隆抗体、别藻蓝蛋白 (APC)标记抗PD-1流式抗体购自美国ebioscience公司。流式洗涤液为含5g/L BSA，1g/L NaN3的PBS。IFN-γ ELISA试剂盒购自晶美公司。非放射性乳酸脱氢酶 (LDH)释放法检测试剂盒Cyto Tox 96购自美国promega公司。

1.3 主要实验仪器 FACSCalibur流式细胞仪为美国BECTON DICKINSON产品。瑞士Tecan SUNRISE酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 HBV转基因小鼠，每组10只。给予相应处理方法，共分4组，即联合组:给予补肾健脾解毒方联合PD-L1抗体;对照组设补肾解毒方组、PDL-1抗体组和PBS组，分别给予补肾解毒方+对照抗体IgG2a、PDL-1抗体+PBS、对照抗体IgG2a+PBS。

1.4.2 给药方式 补肾解毒方:使用时用药浓度为生药含量2.51g/ml，每次灌胃2ml/只，2次/d。PBS:每次灌胃2ml/只，2次/d。PD-L1抗体或对照抗体 IgG2a:腹腔注射，200μg/只，每3日1次，共4次。

1.4.3 实验方案 各组小鼠给予相应药物治疗两周。在治疗结束后脱臼处死小鼠，取脾脏，按常规方法制备浓度为5×106/ml的细胞悬液分别进行以下相应实验检测。

1.4.4 脾脏细胞上清液细胞因子检测 将各组小鼠脾脏细胞分别加入24孔培养板 (1ml/孔)，加 HBsAg(10μg/ml)刺激，37℃、5%CO2培养48小时后，收集培养上清液置于－20℃待检。严格按ELISA试剂盒说明进行操作，酶标仪检测IFN-γ分泌水平。

1.4.5 T细胞表面PD-1分子表达检测 上述脾脏细胞，在24孔培养板中用含rhIL-2(100U/ml)的RMPI-1640完全培养基培养，第4天时，收集细胞，PBS重悬，调整浓度为5×106/ml。取1×106个细胞，分别加入APC标记的抗小鼠PD-1抗体、FITC标记的抗小鼠CD8抗体各20μl，室温避光孵育20分钟;PBS液洗涤1次，加入PBS 200μl重悬，上流式细胞仪检测。每份标本设空白对照。

1.4.6 LDH释放法检测HBsAg特异性CTL活性 ①小鼠脾脏淋巴细胞，用含2mg/L的 ConA、100U/ml rhIL-2、HBsAg蛋白的RMPI-1460完全培养基于37℃、5%CO2条件下培养3天，并调整细胞密度为1×109/L，此即特异性实验中的效应细胞 (HBsAg特异性CTL)。②HepG 2.2.15细胞传代培养，收集后，PBS重悬，调整浓度为1×107/ml。以HepG 2.2.15细胞作为靶细胞，效靶比分别为25∶1，50∶1，100∶1，共培养4小时后，按Cyto Tox 96试剂盒说明书进行杀伤活性检测。CTL杀伤活性=(效靶混合细胞释放OD值－靶细胞自然释放OD值)/(靶细胞最大释放OD值－靶细胞自然释放OD值)×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行相关统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，以方差分析，t检验分析数据。P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 脾细胞上清液分泌IFN-γ水平及CD8+T细胞表面PD-1分子表达水平 见表1。脾脏淋巴细胞培养上清液IFN-γ分泌水平，联合组明显高于PD-L1抗体组、补肾解毒方组、PBS组，统计学分析差异有显著性意义 (P＜0.01或0.05);补肾解毒方组、PDL1抗体组分别与PBS组比较，差异有显著性意义 (P＜0.01或0.05);补肾解毒方组与PD-L1抗体组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。CD8+淋巴细胞表面PD-1分子表达水平，联合组明显低于PD-L1抗体组、补肾解毒方组、PBS组，差异有显著性意义 (P＜0.01);补肾解毒方组、PD-L1抗体组分别与PBS比较，差异有显著性意义 (P＜0.01);补肾解毒方组与PD-L1抗体组比较，差异有显著性意义 (P＜0.01)。

表1 小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平及CD8+T细胞表面PD-1分子表达水平(±s)

表1 小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平及CD8+T细胞表面PD-1分子表达水平(±s)

与PBS组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;与联合组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与PDL-1组比较，##P＜0.01

组别 n IFN-γ(ng/ml) CD8+PD-1+细胞 (%)PBS组 10 121.22±21.33＊＊ 22.5±4.76＊＊补肾解毒方组 10 148.53±22.65△＊＊ 19.3±3.24△△＊＊##PDL-1组 10 159.32±27.35△△＊ 12.2±3.67△△＊＊联合组 10 187.72±29.67△△ 6.7±2.06△△

2.2 小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性 见表2。如表2所示，各组小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性比较:效靶细胞比例为100∶1或50∶1时，联合组明显高于PDL-1抗体组，统计学分析差异有显著性意义 (P＜0.05);联合组、PDL-1抗体组高于补肾解毒方组及PBS，统计学分析差异有显著性意义 (P＜0.01或0.05);补肾解毒方组与PBS组比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。

效靶细胞比例为25∶1时，脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性，联合组高于PBS组，统计学分析差异有显著性意义，(P＜0.05);补肾解毒方组、PDL-1抗体组分别与PBS组、联合组比较，均无统计学差异 (P＞0.05)。

表2 各组小鼠脾脏HBsAg特异性T淋巴细胞杀伤活性

3 讨论

宿主对HBV抗原产生不同程度的特异性免疫无应答即免疫耐受，T细胞处于无能或耗竭状态，被认为是HBV感染慢性化的主要机制［1］。而HBV特异性T细胞免疫应答，尤其是CTL是清除HBV感染的重要方式。因此，有效地清除HBV离不开机体T细胞免疫的重建。

在急性和慢性HBV感染的研究中发现，耗竭或免疫无能的T细胞表面高表达PD-1，导致机体对HBV的免疫耐受［2］。阻断PD-1/PD-L1信号通路，被证实可以恢复病毒感染时无能T细胞的功能，增强疫苗的特异免疫水平［3，4］。封闭PD-l/PDL1通路，如使用PD-L1抗体方法，有可能逆转病毒持续感染和慢性感染。目前该方法应用在抗HBV感染方面较少，有待在HBV转基因动物及临床中进一步研究。

近年来我们依据乙型肝炎“正虚湿热毒邪入侵”的发病机理，采用补肾清透法和补肾健脾法治疗慢性乙型肝炎及携带者，在抑制HBV DNA复制及e抗原的阴转皆有较好的疗效，且对HBV转基因小鼠MHC(主要组织相容性复合体)Ⅰ和MHCⅡ分子表达及T细胞的免疫功能方面有一定的调节作用［5～7］。本研究补肾解毒方中菟丝子、仙灵脾、杜仲、怀牛膝为补肾方阵，共为君药，针对乙型肝炎的正虚本质，固补肾精，可鼓邪外出;叶下珠性苦寒，具清热解毒利湿之效，为臣药;枳壳、郁金行气活血，共为佐药;枸杞子为使药，引诸药入肝血。全方组成针对慢性乙型肝炎的核心病机，君臣佐使配伍合理，先后天并补，虚实兼治，清、补、活一体，共奏补肾解毒、活血利湿之功。为进一步明确HBV慢性感染时补肾解毒方对T细胞免疫的调理作用，我们使用该制剂联合阻断PD-1/PD-L1信号通路的方法，观察其对HBV转基因小鼠特异性T细胞应答水平、T细胞表面PD-1水平的影响，同时探讨促进T细胞功能恢复的有效方法。

本研究结果表明，PD-L1抗体可以阻断PD-1/PD-L1信号通路，降低T细胞表面PD-1分子的表达;提高小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;并且能够显著提高HBsAg特异性CTL杀伤活性。使用补肾解毒方后，PD-L1抗体引起的上述免疫变化进一步增强。提示，补肾解毒方增强应用PD-L1抗体对T细胞功能的恢复作用，能增强特异性T细胞免疫应答水平。

Boni等利用转基因小鼠模型，证实病毒特异性T细胞分泌IFN-γ水平与表面PD-1表达呈负相关［8］。而本研究结果提示，补肾解毒方能显著促进HBV转基因小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平。因此，补肾解毒方能调节Th1/Th2细胞因子的分泌，诱导产生大量IFN-γ，可能为其能减少PD-1表达，提高T细胞免疫功能的原因之一。

总之，本研究表明，阻断PD-1/PD-L1信号通路可以恢复慢性HBV感染时特异性T细胞功能，联合补肾解毒方则具有显著的协同作用。使用合适的中药方剂证实能有效调整慢性HBV感染时T细胞的免疫功能，这无疑为进一步研究重建机体HBV特异性免疫和研制有效的抗HBV的免疫治疗方法提供良好的科学证据和新的思路。

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