多肽固相合成研究进展

黄 蓓

(河南省化工研究所有限责任公司，河南郑州 450052)

多肽是普遍存在于生物体内由氨基酸组成的化学物质，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，由于其具有广泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到药物研发工作者的重视。尤其在20世纪90年代以后，随着多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的活性多肽已被开发并广泛应用于医药、食品、化妆品、农业及畜牧业等领域［1］。

1 多肽概述

由于活性多肽类物质的重要性，合成这些活性物质就成了生物化学家研究的重点和热点之一。而多肽的合成主要是指化学合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成两种途径。液相法在多肽的工业化生产方面有非常重要的应用。固相合成法在20世纪60年代被提出，与经典的液相合成多肽方法相比，由于固相合成大大简化了后处理操作步骤，可以得到较高的收率和产物纯度，易于实现自动化等优点，近几十年来在合成活性多肽类物质方面得到了极大的发展与应用。

2 多肽的固相合成

1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis)，为多肽研究开辟了广阔的天地，并极大地推动了分子生物学等领域的发展，为此1984年Merrifield被授予了诺贝尔化学奖［2］。

2.1 固相合成的基本原理

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

2.2 合成方法

目前固相合成多肽主要有两种方法:一是叔丁氧碳基合成法(Boc合成法);二是9-甲氧羟基合成法(Fmoc合成法)。

图1 多肽固相合成的基本原理

2.2.1 Boc 合成法

采用三氟乙酸(TFA)可脱除的Boc为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc保护的α-氨基酸共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终采用强酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc合成法中，由于要反复地用酸来脱保护以便进行下一步的偶联，这就引入了一些副反应，如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定并发生副反应。

2.2.2 Fmoc 合成法

1978年，Meienlofer和 Atherton等人发展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中，采用了可被碱脱除的Fmoc作为α-氨基酸的保护基，侧链采用酸脱除的Boc保护方法。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，侧链用对碱稳定的Boc进行保护等［3］。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地从树脂上切除，避免了采用强酸［4］。Fmoc法与Boc法相比，由于Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，而被广泛应用于多肽合成中。

2.3 固相合成的聚合物载体与链接分子

2.3.1 聚合物载体

将固相合成与其他多肽合成技术分开来的最主要的特征是固相载体［5］，而能被用作多肽固相载体的聚合物必须满足以下条件:①必须包含合适的连接分子(或反应基团)，使肽链能连接在载体上面，并在以后除去。②必须在合成过程中保持稳定并且不与氨基酸分子反应。③必须提供足够的连接点，以满足肽链的不断增长的需要。目前用于固相合成的聚合物载体主要有三类:聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇类树脂及衍生物。这些聚合物载体只有引入相应的连接分子，才能与氨基酸进行连接。根据连接分子的不同，树脂又被分为几种类型:氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。

2.3.2 连接分子

一个理想的连接分子必须在整个合成过程中十分稳定，并在合成后可以定量的切割下来而又不破坏合成的目标分子［6］，同时连接分子还需要根据与树脂相连的肽的C端的结构类型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物来选择［7］。固相多肽合成使用过的连接分子为含有氯甲基、巯甲基、酰氯基、对苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、邻硝基苄醇基及二苯氯硅烷等的双官能团化合物。

2.4 肽键的形成

固相中肽键的形成原理与液相中的基本一致，应用的方法主要有缩合剂法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中选用 DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法由于在肽键的形成过程中可以减少副反应并抑制消旋的发生，最终得到的多肽收率高等优点而应用最广［8］。

近几十年，随着多肽合成研究的逐步深入，越来越多的肽键缩合剂被设计出来［9-11］(如见图2所示)。DCC、DIC等碳二亚胺类缩合剂，正被更高效的HBTU、BOP、HATU这类脲阳离子和磷正离子的HOBt或HOAt缩合体系取代［12］。这类缩合剂的优点在于克服了DCC在反应过程中产生沉淀的缺点，而且缩合效率明显提高，副反应少，出现的副产物也容易被洗涤出接肽反应体系，且合成目的肽的光学纯度高。特别是随着Fmoc多肽合成法的发现及发展，其缩合剂多采用 TBTU 、HOBt 、DIEA［13-14］，这种缩合剂体系明显缩短了接肽反应时间，减少了副反应，抑制了消旋现象的发生。这些新型的缩合剂及其体系正被应用到更多的合成多肽的反应当中。

图2 常见缩合剂

2.5 多肽的切割与沉淀

按既定的顺序合成完多肽后，就要把目标多肽从树脂上切割下来，并进行进一步的纯化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法两种，因此，它们的切割方法也不完全一样。在Boc法中，主要用TFA+HF裂解和脱侧链保护。在Fmoc法中直接用TFA进行切割。以Fmoc法的切割为例，首先将反应的树脂用二氯甲烷洗涤几遍后，真空抽干。往装有树脂的多肽固相反应器中缓慢加入:三氟乙酸/三异丙基硅烷/ 水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(体积比)溶液，反应3 h，过滤，氮气吹去大部分的溶剂后，向残液中倒入预先冷冻的无水乙醚，离心，倒去上层溶剂乙醚，向沉淀中再次加入无水乙醚，振荡，离心，再重复一次，除去大部分的杂质。将得到的沉淀真空干燥24 h。固体残留物用离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，-20℃保存。

2.6 多肽的纯化

合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等［15］。目前应用最多的是高效液相色谱法，其具体的步骤:将冻干的粗品多肽，溶于20%乙腈/水溶液，用含有0.6%TFA的乙腈/水溶液进行梯度洗脱，收集主要峰产物，减压旋蒸除去乙腈，在冷冻干燥机上冷冻干燥，将目标多肽产品放在-20℃保存。

3 展望

由于多肽类药物在治疗某些疾病方面具有独特的疗效，因此，近几十年来已经引起越来越多的生物化学家和医学家的关注。随着多肽固相合成的提出和发展，人们可以相对简单地用设计合成的多肽分子来进行生物活性的研究等工作。但是，目前人们还只能合成一些相对较短的肽链，而对于相对分子质量较大、肽链较长的蛋白质类物质，固相合成技术还有很大的局限性，同时在合成中要用到大量的有毒试剂，合成费用昂贵，并伴随副反应、消旋化等问题，这些都是不可忽视的问题。因此，寻找更加绿色、环保的多肽合成技术，对科学家来说也是一个重大的挑战。

［1］厉保秋.多肽药物研究与开发［M］.北京:人民卫生出版社，2011.

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