响应面法优化碱提斜生栅藻多糖的提取工艺

贺莹莹，徐小琳，王思雨，王长海，代斌

（1石河子大学化学化工学院／新疆兵团化工绿色过程重点试验室／省部共建国家重点实验室培育基地，石河子832003；2南京农业大学资源与环境科学学院，南京210095）

微藻种类多，生长速度快，周期短，不占用耕地，适应环境能力强，能够进行光合自养并且合成许多结构和生理功能独特的生物活性物质［1－4］，如多糖、蛋白质、色素及不饱和脂肪酸等。微藻多糖具有较强的抗氧化、抗病毒及增强机体免疫力等活性［5－7］，已经成为药物研究的重点。

目前，热水浸提工艺［8－13］被广泛应用于多糖的提取，但此法通常提取温度较高、提取时间较长并且提取效率低下。胡仲秋等［14］采用碱液提取枸杞多糖（LBP），在单因素实验的基础上进行正交实验，结果发现该工艺下LBP得率可达7．46%，比传统水提工艺提高1．59%；Pengrong Wang等［15］采用碱提工艺优化Monascus mycelium 多糖的提取，多糖得率较传统水提方法提高2．10倍，并且碱提多糖清除O2－和DPPH自由基的能力与水提多糖相近。由于微藻中含有部分酸性多糖，因此本实验拟选取碱液提取微藻多糖。多糖提取工艺多为单因素实验和正交设计［16－19］，采用固定其他因素，改变一个因素的单因素考察法确定工艺条件，不能考察因素之间的相互作用，同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系。为了提高多糖的提取效率，采用模型拟合过程更能系统地优化提取工艺。响应面法［20－23］已被成功应用于微生物培养基组分、发酵条件和活性成分提取等工艺的优化，它是通过拟合模型优化过程设置来分析互作效应的数理统计方法，由此能反映出单因素和多种因素间的交互作用，因此被认为是较为准确可靠的优化方法。

从新疆石河子市北湖分离得到的斜生栅藻（Scnedesmus obliquus）与实验室另外3株微藻相比，其生物量和多糖含量都相对较高，且该藻株在稳定期能大量自絮凝，使藻体与培养液分离，有利于藻体的后续大规模采收。因此，本文实验选用斜生栅藻的干藻粉为原料，利用单因素实验考察碱液浓度、提取温度和提取时间对其多糖提取率的影响。在此基础上，采用响应面分析法优化提取参数，得到碱提斜生栅藻多糖的最佳工艺条件，为进一步研究斜生栅藻多糖的活性奠定基础。

1 实验材料和方法

1．1 材料

1．1．1 供试藻株及培养条件

斜生栅藻（Scnedesmus obliquus）分离于新疆石河子北湖，经形态学鉴定为斜生栅藻，保藏于新疆兵团化工绿色过程重点实验室。将斜生栅藻藻种接种于改良BG11培养基中，置于自制光照培养架上，培养条件为：温度（24．0±2．0）℃，光照条件4000lx，连续光照，每天定时摇瓶3次并交换位置，确保微藻藻液均匀光照，避免长时间静置。藻液培养至稳定期后，离心收获，经蒸馏水洗涤2次，冷冻干燥机干燥，保存于干燥器中，待用。

1．1．2 试剂及仪器

无水乙醇、浓硫酸、蒽酮和葡萄糖等其它试剂均为国产分析纯。LXJ－IIB低速大容量多管离心机，上海圣科仪器设备有限公司；FA1104B电子天平，上海越平科学仪器有限公司；PK－8D电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；GZX－9140MBE电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ALPHR 1－2LD 冷冻干燥仪，德国Christ公司；V－1100D型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1．1．3 培养基

改 良 的 BG11 培 养 基：NaNO30．004g／L，K2HPO4·3H2O 0．240g／L，MgSO4·7H2O 0．212 g／L，CaCl2·H2O 0．036g／L，柠檬酸0．006g／L，柠檬酸铁铵0．024g／L，EDTA Na20．001g／L，Na2CO30．020g／L，NaHCO31．424g／L和1mL／dL的微量元素溶液。微量元素溶液包含：H3BO32．860g／L，MnCl4·H2O 1．860g／L，ZnSO4·7H2O 0．220g／L，NaMoO4·2H2O 0．390g／L，CuSO4·5H2O 0．080 g／L和Co（NO3）2·6H2O 0．050g／L。

1．2 方法

1．2．1 标准曲线绘制

采用蒽酮－硫酸法［24］以葡萄糖为标准品制作标准曲线。准确称取100mg 105℃恒重的葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100mL，分别取出1、2、3、4、5mL加入到50mL的容量瓶中，配成浓度为20、40、60、80、100μg·mL－1的溶液。各取1 mL于20mL具塞试管中，再加入4mL的蒽酮试剂，待几支试管均加完后，同时浸入100℃恒温水浴箱中，准确保温10min后取出，立即用流动水冷却。于室温下平衡约5min左右，以1mL的蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度。得标准曲线方程：A＝0．0069C＋0．0025，相关系数R2＝0．9991。

1．2．2 多糖的提取工艺及提取率计算

准确称取斜生栅藻干藻粉50．0mg，加入5mL不同浓度的碱液，于超声波清洗仪超声混匀10min后置于电热恒温水槽中，在设定的温度下反应一定的时间后离心，向上清液中加入3倍体积95%的乙醇，置于4℃冰箱中沉淀过夜后离心，将沉淀复溶于蒸馏水中，定容至100mL，取1mL利用蒽酮比色法测定其多糖含量，并计算多糖提取率。多糖提取率用式（1）计算：

其中：C表示由标准曲线计算得出的多糖的浓度，μg／mL；V表示多糖提取液定容后的总体积，mL；W表示实验样品的重量，mg。

1．3 实验设计

采用Box－Benhnken中心组合实验设计优化斜生微藻多糖的提取工艺。令多糖提取率为响应值，采用 Design－Expert（v．7．1．6，Stat－Ease，Inc，Minneapolis，USA）软件进行实验设计和数据分析，并建立回归模型。采用多项式回归分析对实验数据进行拟合，得到二次多项式为：

式（2）中：Y 是响应值；A0是常数；Ai，Aii和Aij分别代表一次项、二次项和交互作项的回归系数；Xi和Xj是自变量的水平。

2 结果与讨论

2．1 单因素实验

影响微藻多糖提取率的因素较多，其中碱液浓度、提取温度、提取时间3个因素影响较为显著。本研究先通过单因素实验确定实验因素与水平，再进行响应面分析实验设计。

2．1．1 碱液浓度对斜生栅藻多糖提取率的影响

绿藻中含有部分酸性多糖，它们随着提取液碱性的增强，更易被溶出；另外，以非共价键形态结合在一起的多糖与蛋白质等物质在碱性条件下更易解离，因而多糖易被释放出来。因此，本实验采用碱液对斜生栅藻多糖进行提取。固定碱液浸提温度为80．0℃，提取时间为2．0h，设定碱液质量浓度分别为0、0．025、0．075、0．125、0．175、0．225mol／L，实验结果见图1。

图1 碱液浓度对斜生栅藻多糖提取率的影响Fig．1Effect of alkali concentration on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

由图1可知：在一定温度下，加入碱液可以显著提高多糖的提取率，但当碱液质量浓度超过0．175 mol／L后，多糖提取率增加不明显，并且碱液浓度过高，多糖因降解而使得率下降。综上所述，碱液质量浓度选取在0．175mol／L较为合适。

2．1．2 提取温度对斜生栅藻多糖提取率的影响

固定碱液浓度为0．175mol／L，提取时间为2．0 h，设定水浸提温度分别为50．0、60．0、70．0、80．0、90．0、100℃，实验结果见图2。

由图2可知：随着温度升高，多糖提取率增加显著，但升高至90．0℃之后，多糖提取率有下降趋势，其原因可能与多糖本身的稳定性有关。在碱液提取时，较高温度可能破坏多糖结构，导致其提取率下降。单因素实验结果显示，提取温度在80．0℃左右比较合适。

图2 提取温度对斜生栅藻多糖提取率的影响Fig．2Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．1．3 提取时间对斜生栅藻多糖提取率的影响

提取时间是影响微藻多糖提取效率另一个较重要的因素。固定碱液质量浓度为0．175mol／L，提取温度为80．0℃，设定碱液浸提时间分别为0．50、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0h，实验结果见图3。

图3 提取时间对斜生栅藻多糖提取率的影响Fig．3Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．2 中心组合实验（BBD）

2．2．1 Box－Benhnken的中心组合设计及结果分析

影响微藻多糖提取率的因素并不是孤立发生作用的，它们之间共同发生作用才最终影响微藻多糖的提取率，因此，下面采用Box－Benhnken中心组合设计，以碱液质量浓度、提取温度和提取时间为自变量，分别以X1、X2和X3表示，以斜生栅藻多糖提取率为因变量，即响应值，设计三因素三水平相应分析实验，分别用－1、0、1表示三水平的高、中、低水平。具体编码水平如表1所示，中心组合实验方案及其实验结果如表2所示。

表1 Box－Behnken响应面设计实验因素及水平Tab．1Variables and levels in response surface design

表2 响应面实验设计及结果Tab．2Experimental design and results of response surface methodology

通过 Design Expert 7．1．6软件对实验结果进行多元回归分析，得出碱提斜生栅藻多糖提取率的二阶模型，方程如下：

式（3）中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，p值越小，则相应变量的响应程度就越高。

由表3可知：上述模型可描述各因子与响应值之间的关系，模型p＜0．001，表明该回归模型极其显著；失拟项p为0．6918，不显著；相关系数R2＝0．9890，说明该模型拟合度良好，实验误差较小；R2Adj为0．9749，表明上述模型可以解释97．49%响应值的变化。综上所述，此模型可分析和预测斜生栅藻多糖提取率。此外，各因素中一次项X1、X2、X3以及二次项X12和X22为极显著，因此，各实验因素对响应值的影响并非简单的线性关系。

表3 斜生栅藻多糖提取预测回归模型的方差分析Tab．3Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

2．2．2 影响斜生栅藻多糖提取率的因素分析

响应面法的优势在于可以高效地确定自变量的最优值，使得响应值最大化。各个因素及其交互作用对斜生栅藻多糖提取率的影响结果可通过响应面图和等高线图直观的反映出来，本实验响应面图和等高线图见图4至6。

由图4至6可知：提取碱液质量浓度对斜生栅藻多糖得率的影响最大，随着温度的增加，多糖得率也随之增加，若提取温度超过80．0℃，多糖得率反而会降低；提取时间对多糖得率也有一定的影响，但时间的增加对多糖得率影响较小，从节省成本和能耗的角度考虑，增加提取时间并无益处。

采用Design－expert软件对实验结果进行分析，获得斜生栅藻多糖提取的最佳条件为：碱液质量浓度0．175mol／L，提取温度为80．8℃，提取时间2．1 h，在此条件下，斜生栅藻多糖提取率理论值可达到10．91%。

图4 碱液质量浓度和提取温度对斜生栅藻多糖提取率影响的响应面和等高线图Fig．4Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction temperature on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

图5 碱液质量浓度和提取时间对斜生栅藻多糖提取率影响的响应面和等高线图Fig．5Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

图6 提取温度和提取时间对斜生栅藻多糖提取率影响的响应面和等高线图Fig．6Response surface and contour plot showing the interactive effects of extraction temperature and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

2．2．3 验证实验

1）根据拟合的最优工艺条件，以碱液质量浓度0．175mol／L、提取温度80．8℃、提取时间2．1h对斜生栅藻多糖进行提取，提取率达到11．08%，与模型预测值接近，说明该模型预测性和可靠性很好。

2）与热水浸提［8］（90．7℃5．1h）斜生栅藻多糖的提取率（1．93%）相比，碱液浸提优化后的多糖提取率提高了4．74倍。碱提和热水浸提斜生栅藻多糖的单位时间（h）提取率分别为5．28% 和0．37%，前者是后者的14．27倍，说明碱液浸提法同时提高了斜生栅藻多糖的提取效率。

3 结论

1）建立了响应值与各因素之间的数学模型，并根据此二次回归模型，确定了斜生栅藻多糖的碱提最佳工艺参数为碱液质量浓度0．175mol／L，提取温度80．8℃，提取时间2．1h。此工艺条件下提取斜生栅藻多糖的提取率达到11．08%，与模型预测值接近，并且建立的数学模型（R2＝0．9890）能很好地反映各因素与提取率之间的关系。

2）优化后的碱提斜生栅藻多糖提取率和提取效率较热水浸提法分别提高了4．74和13．27倍。表明碱液有利于斜生栅藻多糖的提取，也验证了响应面法优化碱提斜生栅藻多糖工艺是可行的。

［1］曹键，漆开华，高孔荣．微藻的研究进展［J］．广州食品工业科技，1996，12（4）：5－9．

［2］卢仡，林红华，柯群．微藻的生物活性物质及其功能［J］．食品工业科技，2011，32（7）：470－473．

［3］Singh S，Kate B N，Banerjee U C．Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae：an overview［J］．Critical reviews in biotechnology，2005，25（3）：73－95．

［4］Amaro H M，Guedes A C，Malcata F X．Antimicrobial activities of microalgae：an invited review［J］．Science against Microbial Pathogens：Communicating Current Research and Technological Advances，2011（3）：1272－1284．

［5］周杰，陈安国．海藻多糖的生物活性研究进展［J］．饲料工业，2005，26（18）：12－15．

［6］Costa M S S P，Costa L S，Cordeiro S L，et al．Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa cupressoides var．flabellata［J］．Journal of Applied Phycology，2012，24（5）：1159－1167．

［7］Lee J B，Takeshita A，Hayashi K，et al．Structures and antiviral activities of polysaccharides from Sargassum trichophyllum［J］．Carbohydrate Polymers，2011，86（2）：995－999．

［8］熊皓平，黄和，王博，等．响应面法优化硇洲马尾藻多糖提取工艺［J］．食品研究与开发，2011，32（5）：52－56．

［9］张秀红，李宏全，李加高，等．响应面法优化钝顶螺旋藻FACHB－439多糖提取工艺［J］．生物技术，2010，20（6）：72－75．

［10］钱森和，厉荣玉，魏明，等．普通念珠藻多糖提取及其体外抑菌活性研究［J］．食品科学，2012，33（6）：96－99．

［11］Ye C L，Hu W L，Dai D H．Extraction of polysaccharides and the antioxidant activity from the seeds of Plantago asiatica L．［J］．International journal of biological macromolecules，2011，49（4）：466－470．

［12］Ye C L，Jiang C J．Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Plantago asiatica L．by response surface methodology［J］．Carbohydrate Polymers，2011，84（1）：495－502．

［13］Sun Y，Li T，Yan J，et al．Technology optimization for polysaccharides（POP）extraction from the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus by Box－Behnken statistical design［J］．Carbohydrate Polymers，2010，80（1）：242－247．

［14］胡仲秋，刘建党，王保玲．枸杞多糖的碱液提取工艺研究［J］．西北农林科技大学学报：自然科学版，2008，36（1）：173－178．

［15］Wang P，Chen D，Jiang D，et al．Alkali extraction and in vitro antioxidant activity of Monascus mycelium polysaccharides［J］．Journal of Food Science and Technology，2012，80（4）：1057－1061．

［16］任守利，刘塔斯，刘宇婧，等．天麻多糖提取工艺的研究［J］．湖南中医药大学学报，2010，30（1）：37－40．

［17］郭守军，杨永利，姚慕贞，等．蜈蚣藻多糖提取工艺优化［J］．食品科技，2010，35（6）：227－230．

［18］Tian S，Zhou X，Gong H，et al．Orthogonal test design for optimization of the extraction of polysaccharide from Paeonia sinjiangensis K．Y．Pan［J］．Pharmacognosy Magazine，2011，7（25）：4－8．

［19］Jiang B，Zhang H，Liu C，et al．Extraction of water－soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves［J］．Medicinal Chemistry Research，2010，19（3）：262－270．

［20］宋丽军，张丽，尹琳琳，等．响应面法在超高压钝化哈密瓜汁中两种酶研究上的应用［J］．石河子大学学报：自然科学版，2010，28（5）：600－605．

［21］孙佰平，任娟，赵思峰，等．响应面法优化球孢白僵菌CXJ－1的发酵工艺条件［J］．石河子大学学报：自然科学版，2012，29（6）：689－695．

［22］肖国民，潘晓梅．响应面法优化螺旋藻中叶绿素的超声提取工艺［J］．化工学报，2009，60（11）：2813－2819．

［23］王仙，王祥军，曹连莆，等．大麦籽粒总黄酮超声辅助提取工艺的优化［J］．石河子大学学报：自然科学版，2010，28（2）：152－157．

［24］Yemm E W，Willis A J．The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone［J］．Biochemical Journal，1954，57（3）：508－514．