甘草查尔酮B体外细胞毒作用研究

冉芳，杨帆，杨新惠，王振华，张波，郑秋生

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子，832002）

甘草查尔酮B（Licochalcone B，LCB）是一类查尔酮类化合物。查尔酮类化合物分子能与不同的生物受体结合，对肿瘤细胞增殖具有显著的抑制作用，其作用机制包括：抑制微管蛋白聚合、抗血管生成、诱导凋亡、抗雌激素以及逆转多药耐药性［1］。研究表明，查尔酮是具有应用前景的新型抗肿瘤先导化合物。本研究旨在观察甘草查尔酮B对肿瘤细胞的增殖抑制作用，初步探讨其作用机制，为进一步研究甘草查尔酮B的抗肿瘤作用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 细胞株与药物

MCF－7、T24、HeLa、B16F10、B16F0购买于中国典型培养物保藏中心，本实验室保种。甘草查尔酮B购自上海丽臣公司，纯度大于98%，用DMSO配制成2×104μg／mL母液备用，用前用完全培养基稀释成所需浓度，各给药组DMSO浓度不大于0．5%。

1．2 主要试剂

RPMI1640培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）购自Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）、台盼蓝（Typan blue）购自北京拜尔迪生物技术公司；JC－1染料购自Sigma公司。

1．3 方法

1．3．1 细胞增殖实验

细胞增殖实验使用MTT法，于96孔板中进行。取对数生长期细胞按5000个／孔接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，设不同浓度梯度，加药100μL，每组设6个复孔，继续培养24h后，每孔加入 MTT工作液（5．0mg／mL）20μL，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入150μL DMSO，微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，酶标仪在570nm检测波长，630nm参考波长下检测每孔的吸光度（A）值。

计算药物对细胞增殖的抑制率（IR）＝（1－A给药孔／A对照孔）×100%，再根据药物浓度对应细胞增殖抑制率作线性回归，根据直线方程计算药物对细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）。

1．3．2 台盼蓝拒染法测定致死率［2］

取细胞对数生长期的B16F0细胞，计数并调整细胞悬液的浓度为1×105／mL，按3mL孔加入6孔板中，加甘草查尔酮B，其终浓度分别为5．0、7．5、10．0、12．5μg／mL，培养24h。取90μL细胞悬液加于200μL离心管中，再加入10μL0．4%台盼蓝染液，用细胞计数器计数死细胞个数，计算甘草查尔酮B对B16F0细胞的致死率。

1．3．3 相差显微镜观察细胞形态学

取细胞对数生长期的B16F0细胞，计数并调整细胞悬液的浓度为1×105／mL，按3mL／孔加入6孔板中，加甘草查尔酮B，其终浓度分别为7．5和12．5μg／mL，培养24h，于倒置相差显微镜观察细胞数。

1．3．4 线粒体膜电势测定

取甘草查尔酮B处理2h的B16F0细胞，台盼兰染色法进行计数，取1×106个／mL细胞，离心（1500g×5min），弃上清液，加2mL PBS缓冲液润洗一次，加100μL的10μmol／L JC－1荧光染料重悬细胞、混匀，然后将细胞置于37℃水浴中20 min，用PBS润洗2次，洗去未结合的荧光染料，酶标仪进行线粒体膜电势检测红色／绿色荧光强度比值衡量线粒体去极化程度。

1．3．5 数据处理

2 结果与分析

2．1 甘草查尔酮B对5种细胞的生长抑制作用

实验结果见表1。

由表1可知：甘草查尔酮B以不同浓度分别作用于 MCF－7、T24、HeLa、B16F10、B16F0 5种肿瘤细胞24h后，细胞生长均受到不同程度的抑制，并呈量效关系，其IC50分别为12．1、11．12、12．38、12．14、10．73μg／mL。

为了进一步研究甘草查尔酮B对肿瘤细胞增殖机制，我们在下面试验中选取B16F0细胞作进一步探讨。

表1 甘草查尔酮B对5种细胞的生长抑制作用X±S，n＝3Tab．1Growth inhibition of LCB in five kinds cell

2．2 甘草查尔酮B对B16F0细胞致死率

不同浓度甘草查尔酮B（5～15μg／mL）处理24 h后，采用台盼蓝拒染法对B16F0细胞的致死率进行检测，结果见图1。

图1 甘草查尔酮B对B16F0细胞致死率的影响Fig．1Effects of LCB on the fatality rate in B16F0cells

由图1可知：甘草查尔酮B以不同浓度作用于B16F0细胞24h后，随着药物浓度的增加，细胞的死亡率也增加。

2．3 细胞形态学变化

相差显微镜下观察细胞，结果如图2所示。

由图2可知：正常B16F0贴壁生长，分布均匀，细胞接触紧密。甘草查尔酮B作用于细胞24h后，细胞间隙增大，脱壁细胞增多漂浮在培养基中，并且随着药物浓度的增加，上述变化愈加明显。

2．4 甘草查尔酮B对B16F0细胞△ψm的影响

结果见表2。

图2 相差显微镜观察B16F0细胞形态学变化Fig．2The effect of LCB on morphological changes of B16F0cell under phase contrast microscope

由表2可知：JC－1是一种阳离子荧光染料，由于线粒体内膜的电负性而聚集在活细胞线粒体内形成多聚体，呈鲜红色荧光；但在凋亡细胞内，由于△Ψm的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质发绿色荧光；红色／绿色荧光强度比例下降，通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。B16F0细胞经5、7．5、10、12．5、15μg／mL的甘草查尔酮B作用24h后，线粒体膜电势降低，且呈现浓度依赖关系。

表2 甘草查尔酮B对B16F0细胞△ψm的影响X±S，n＝3Tab．2Effects of LCB on△ψm in B16F0cells

3 讨论

甘草查尔酮B是一类查尔酮类化合物。甘草查尔酮B具有显著的抗菌作用，对革兰氏阳性菌具有较强的抑制活性［3］。甘草中的5种查尔酮类成分均具有抗氧化作用，其中以甘草查尔酮B和C的作用最为显著，认为查尔酮的B环结构与抗氧化活性密切相关［4－6］。甘草查尔酮A和B能够增加花生四烯酸的形成，抑制凝血酶诱导的血小板聚集作用［7］。本研究通过MTT和台盼蓝检测发现，甘草查尔酮B对B16F0细胞的恶性增殖具有抑制作用，并且诱导线粒体膜电势降低，且呈现浓度依赖关系。

本研究发现甘草查尔酮B对5种细胞增殖活性均有抑制作用，并且细胞生长均受到不同程度的抑制，且呈量效关系。选取B16F0细胞进行台盼蓝拒染实验，随着药物浓度的增加，细胞的致死率略微有所增加，与对照组相比，药物处理组并无显著差异。肿瘤细胞的增殖受到抑制的可能机制主要有4种：1）是引起细胞的死亡（包括凋亡）；2）是引起细胞周期各时相的等比例延长；3）是细胞被阻滞在周期中的某一个时相；4）是细胞发生再分化，失去了肿瘤细胞的恶性特征［8］。

研究表明，在不同因素诱导的细胞凋亡中，在细胞形态学改变之前均出现线粒体膜电位的下降。可见，线粒体膜电位下降是凋亡的早期表现，一旦线粒体膜电位损耗，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。抑制线粒体膜电位下降，就可能阻抑细胞凋亡的发生，说明线粒体膜电位下降为凋亡的特征性改变［9］。经对诱导凋亡后的细胞进行流式细胞术分析检测也表明，线粒体膜电位的下降要早于DNA断裂和胞膜磷脂酰丝氨酸外翻，也早于凋亡时细胞的形态学改变、蛋白酶Caspase－3激活等变化，提示线粒体膜电位下降是凋亡早期阶段［10］。本实验应用JC－1染色，发现甘草查尔酮B各浓度作用于B16F0细胞24 h后，线粒体膜电势降低，且呈现浓度依赖关系。由此推测，甘草查尔酮B对B16F0细胞的增殖抑制作用可能与其诱导细胞凋亡的作用有关。

综上所述，甘草查尔酮B能够抑制B16F0细胞的恶性增殖。实验结果检测到甘草查尔酮B以不同浓度作用于B16F0细胞，随着药物浓度的增加，细胞的致死率略微有所增加；相差显微镜下观察细胞，细胞增殖变慢，细胞间隙增大，脱壁细胞增多漂浮在培养基中，并且随着药物浓度的增加，上述变化愈加明显；线粒体膜电势降低，且呈现浓度依赖关系。从而推测，甘草查尔酮B对B16F0细胞的增殖抑制作用可能与其诱导细胞凋亡的作用有关。虽然甘草查尔酮B对B16F0细胞的增殖抑制作用机制还不清楚，但是本研究结果表明，更深入地探讨其诱导细胞凋亡的分子机制是十分有价值的，甘草查尔酮B有可能成为治疗恶性肿瘤的候选化合物。

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