茜草中总黄酮的超声提取工艺研究

王建壮，施玉旋，郑荣杰，周晔，程力惠，吕华冲*

(1.广东药学院 药科学院，广东 广州 510006；2.中山大学 孙逸仙纪念医院 药学部，广东 广州 510120；3.广东省第二人民医院 药学部，广东 广州 510317)

中药工业

茜草中总黄酮的超声提取工艺研究

王建壮1，施玉旋2，郑荣杰3，周晔1，程力惠1，吕华冲1*

(1.广东药学院 药科学院，广东 广州 510006；2.中山大学 孙逸仙纪念医院 药学部，广东 广州 510120；3.广东省第二人民医院 药学部，广东 广州 510317)

目的：优化茜草中总黄酮的超声提取工艺。方法：以硝酸铝显色法测定总黄酮提取率，通过单因素试验探讨了乙醇浓度、料液比、提取时间等因素对总黄酮提取率的影响，并采用正交试验确定了最佳提取条件。结果：茜草总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度60%，料液比1∶30，提取时间50 min，此条件下总黄酮的提取率为2.730%。结论：与传统提取方法相比，该工艺提取效率高、提取时间短，操作简单且结果稳定。

茜草；超声波提取；总黄酮；正交试验

茜草为茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根茎。性苦，寒。归肝经。具有凉血，祛瘀，止血，通经的作用。用于吐血，衄血，崩漏，外伤出血，瘀阻经闭，关节痹痛，跌扑肿痛[1]。目前，已经报道的茜草总黄酮的提取方法有实验微型法、常规溶剂法[2]和热浸提法[3]，这些方法都比较耗时耗能，而且提取效率不高。超声波提取技术具有能耗低、效率高、可避免高温对提取成分的影响等优点，已广泛应用于提取植物中的生物碱、苷类、黄酮类等生物活性物质[4]。为了提高茜草总黄酮的提取效率，作者采用乙醇为溶剂和超声波辅助提取技术，利用正交试验法对茜草总黄酮的提取工艺进行优化。

1 材料与仪器

芦丁对照品(成都曼特生物科技有限公司，批号：MUST-11040302，含量：99%)；茜草(广州大参林药房)；NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇及其他试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

UV-2550紫外可见分光光度计(岛津香港有限公司)；KH-3200DB超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；JA1203N电子天平(上海精密科学仪器公司)；循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的配制[3]准确称取干燥至恒定质量的芦丁对照品11.4 mg，用80%的乙醇溶解，转入100 mL容量瓶，用80%乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.114 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

2.1.2 测定波长的选择 准确吸取上述对照品溶液5.0 mL置25 mL量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，然后加1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液静置6 min后，再加入10.0 mL 4%NaOH溶液，最后用80%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10 min；以空白试剂为对照，用紫外可见分光光度计在400～700 nm下进行扫描，对照品溶液在504 nm处有最大吸收，因此测定波长选择504 nm。

2.1.3 标准曲线的绘制[3]准确吸取上述对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 分别置于10 mL容量瓶中，各加80%乙醇溶液至5 mL，加5%NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，摇匀，再放置6 min，加4%NaOH溶液4 mL，摇匀放置15 min，在504 nm处测定各对照品溶液的吸光度值，以芦丁质量浓度(X)对吸光度值(Y)作图，绘制标准曲线，计算回归方程Y=11.158X-0.014，r=0.999 5。

2.1.4 样品中总黄酮的提取和含量测定 将茜草干燥，粉碎过筛。取一定量的粉末置索氏提取器中，加适量石油醚60 ℃提取至无色，放冷，取出粉末，自然挥干石油醚后，备用。分别准确称取样品粉末1.0 g置于具塞锥形瓶中，加入相应浓度和料液比的乙醇溶液，然后置于超声波清洗器中，按相应的时间进行超声提取，提取2次。提取液离心分离，过滤除渣，用提取溶剂定容至100 mL量瓶中，得到样品溶液，备用。准确吸取样品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶，按2.1.3项下方法操作，测定吸光度(A)，然后按公式计算总黄酮提取率：

式中：W为茜草粉质量(g)。

2.1.5 稳定性试验 取其中一份样品溶液，按2.1.3项方法显色，在15，30，45，60，75，90 min时测定其吸光度，结果发现在90 min内RSD=1.77%，说明样品溶液显色15 min后，在90 min内较稳定，结果较可信。

2.1.6 加样回收率试验 分别准确吸取2 mL的已知总黄酮含量的样品溶液9份，分别按样品总黄酮含量的80%，100%和120%加入芦丁对照品，形成低、中、高3种浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，按2.1.3项方法显色并测量其吸光度，计算其加样回收率。结果表明，其平均回收率为99.86%，RSD=1.07%，符合分析要求。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响 在超声30 min、料液比为1∶30的条件下，考察乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，结果如图1所示。 随着乙醇浓度的增大，总黄酮的提取率也相应增大，当乙醇浓度达到60%时，总黄酮提取率达到最高，当乙醇浓度高于60%时，总黄酮提取率不增加反而下降。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

2.2.2 料液比对总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度为60%、超声时间为30 min的条件下，考察不同料液比对总黄酮提取率的影响。结果如图2所示。随着料液比的比例加大，总黄酮提取率呈明显上升趋势，料液比1∶30之后增加不明显。

图2 料液比对总黄酮提取率的影响

2.2.3 提取时间对总黄酮提取率的影响 在乙醇浓度为60%，料液比为1∶30的条件下，考察不同时间对总黄酮提取率的影响。结果如图3所示。随着超声提取时间的增加，总黄酮类物质提取率增加，当提取时间为50 min时，黄酮提取率达到最高，随后提取率逐渐降低。

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.3 正交试验

以总黄酮提取率为评价指标，分别考察不同乙醇浓度、料液比、提取时间在超声提取条件下对茜草中总黄酮提取效果的影响。根据单因素试验结果，对影响总黄酮提取效果的3个主要因素设置3个水平(见表1)，用L9(34)进行正交试验设计，选择最佳提取工艺条件。结果见表2。

由表2中的极差可知，各考察因素对提取效果影响的大小顺序为：C>B>A，即乙醇浓度>料液比>提取时间。最佳的提取工艺为C2B2A2，即乙醇浓度为60%，料液比为1∶30，提取时间为50 min。将试验结果进行方差分析，结果如表3所示。由表3可知，乙醇浓度、料液比和提取时间差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1 茜草总黄酮提取正交试验因素水平表

表2 茜草总黄酮提取正交试验

表3 方差分析表

注：n=2

2.4 最佳条件的验证

准确称取石油醚脱脂后的茜草粉末3份，每份1.0 g，根据最佳提取工艺条件C2B2A2提取，按2.1项方法测定提取率，平均总黄酮提取率为2.730%。结果表明，根据最佳提取条件所得的总黄酮提取率均比正交设计表中其他提取条件下的总黄酮提取率高，3次平行实验结果RSD=1.05%，表明该工艺条件合理、稳定、可行。

3 讨论

单因素试验中，当乙醇浓度高于60%时，茜草中的其他非黄酮类物质也被更多地提取出来，特别是一些亲脂性、醇溶性强的成分的溶出，加大了同黄酮类物质的溶剂竞争，使得总黄酮提取率下降[5]。

通过单因素试验和正交试验设计方法的有效结合，对超声波提取血茜草中总黄酮的提取工艺条件进行筛选，得到最佳提取工艺：乙醇浓度60%，料液比1∶30，提取时间50 min，在此条件下茜草总黄酮的提取率为2.730%。与文献[3]报道的传统回流方法比较，本方法具有提取效率高、节能、提取时间短、总黄酮提取率高、稳定和易操作等优点，是一种较理想的提取茜草总黄酮的方法。研究为进一步推动茜草总黄酮的利用、加大开发利用茜草资源提供科学参考。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国科技医药出版社，2010：218-219.

[2] 斯琴毕力格，曲长明，李增春.茜草中提取总黄酮实验微型法与常规法的比较[J].内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2008，23(3)：269-271.

[3] 田春莲，蒋凤开.茜草总黄酮提取工艺研究[J].食品科学，2011，32(24)：60-63.

[4] 白明生，陈彦云，李国旗.洋葱皮总黄酮的超声波提取工艺研究[J].食品科技，2008，33(12)：190-193.

[5] 陈文娟，陈建福.漳州血柚皮总黄酮超声波辅助提取工艺研究[J].常熟理工学院学报(自然科学)，2012，26(4)：57-63.

OptimizationofUltrasonicExtractionProcessofTotalFlavonoidsinRubiaeRadixEtRhizoma

WANG Jian-zhuang1，SHI Yu-xuan2，ZHENG Rong-jie3，ZHOU Ye1，CHENG LI-hui1，LYU Hua-chong1*

(1.SchoolofPharmacy，GuangdongPharmacologicalUniversity，Guangzhou510006，China；2.DepartmentofPharmacy，SunYat-senMemorialHospital，SunYat-senUniversity，Guangzhou510120，China；3.DepartmentofPharmacy，theSecondPeople’sHospitalofGuangdong，Guangzhou510317，China)

Objective：To optimize the ultrasonic extraction process of total flavonoids in Rubiae Radix et Rhizoma.Methods：The effect factors to extraction rate including ethanol concentration，ratio of solid to liquid，extraction time，which measured by coloration method with alu minum nitrate，were investigated by single factor test，and the optimal conditions of extraction were obtained by orthogonal test.Results：The extraction rate of total flavonoids in Rubiae Radix et Rhizoma was 2.730% under the optimal extracting conditions：ethanol 60%，ratio of material to liquid 1∶30 and extraction time 50 min.Conclusion：Compared with traditional way，the optimized ultrasonic extraction process is efficient，rapid，simple，and stable.

Rubiae Radix et Rhizoma；Ultrasonic extraction；Total flavonoids；Orthogonal test

2013-08-12)

*

吕华冲，硕士生导师，副教授，主要从事天然药物活性成分及质量标准研究；Tel：(020)39352140，E-mail：wjz506@163.com