穿龙薯蓣种子质量检验方法研究△

涂秀文，尹海波*，安晔，陈静，姚佳，王洪成

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.中国人民解放军沈阳军区总医院 药剂科，辽宁 沈阳 110002)

中药农业

穿龙薯蓣种子质量检验方法研究△

涂秀文1，尹海波1*，安晔2，陈静1，姚佳1，王洪成1

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.中国人民解放军沈阳军区总医院 药剂科，辽宁 沈阳 110002)

目的：研究穿龙薯蓣种子质量检验方法，为穿龙薯蓣种子检验规程和质量标准的制定提供依据。方法：参考国际植物种子检验规程和农作物种子检验规程的方法对不同产地穿龙薯蓣种子质量进行测定。穿龙薯蓣种子净度分析送检样本最少500 g，试验样本最少50 g；真实性检验采用种子外观形态比较；质量测定采用百粒重；含水量测定采用高温烘干法3 h；发芽前处理采用5 ℃低温层积20 d，然后用100 mg·L-1的GA3溶液浸种30 h方法，种子发芽采用20 ℃恒温砂石培养床萌发；生活力采用TTC染色法，染色温度为45 ℃，TTC浓度为0.6%，染色时间为4 h。结果：穿龙薯蓣种子生活力和种子发芽率呈显著正相关，发芽率Y对生活力X回归方程为Y=-10.591+1.058X。结论：初步建立了穿龙薯蓣种子扦样，净度分析，真实性鉴定，质量，含水量，发芽及生活力7项指标的检验方法。

穿龙薯蓣；种子；质量检验方法；生活力；发芽率；相关性

穿龙薯蓣DioscoreanipponicaMakino为薯蓣科多年生草本植物，干燥根茎入药，药材习称穿山龙[1]，为东北地区常用道地中药，有祛风除湿，舒筋通络，活血止痛，止咳平喘等功效；用于风湿弊病，关节肿胀，疼痛麻木，跌扑损伤，闪腰岔气，咳嗽气喘等证。现代研究证明穿龙薯蓣有调节免疫、改善心血管功能、镇咳 祛痰、平喘等药理作用，在临床上治疗类风湿性关节炎、冠心病、心绞痛、慢性气管炎、慢性布鲁苗病、脂肪瘤等疗效较好。

目前穿龙薯蓣在我国北部有大面积栽培，人工栽培主要通过种子繁殖，而种子基本来自于野生，种源混杂，因而种子质量的优劣直接影响着药材的产量和质量，亟待规范市场流通用种质量。本实验对反映穿龙薯蓣种子质量主要指标的检验方法进行了研究，以期为穿龙薯蓣种子检验规程和质量标准的制定提供科学依据。

1 材料

实验所用穿龙薯蓣种子为2012年8～9月采自黑龙江伊春，吉林集安，辽宁抚顺3个产区的栽培居群和辽宁千山的野生居群，经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为穿龙薯蓣DioscoreanipponicaMakino的种子。

2 方法

2.1 扦样

根据穿龙薯蓣种子的市场流通情况和单次可能的交易量，及净度分析试验样品不少于2500粒种子，而送检样品的质量应超过净度分析量的10倍量的原则，确定穿龙薯蓣种子批的最大和样品的最小质量。按农作物种子检验规程(GB/T3543-1995)扦样方法扦取送检样品和试验样品[2-4]。

2.2 种子净度分析

按农作物种子检验规程(GB/T3543-1995)净度分析执行。分别选取各产地种子50 g，进行净种子和杂质的质量测定，重复三次。

2.3 真实性鉴定

采用种子外观形态法，随机选取100粒净种子，4次重复，逐粒用显微镜和游标卡尺等相关仪器进行外观形态观察，并记录其结果。

2.4 质量测定

分别采用百粒法和千粒法测定每份种子样品质量。(1)百粒法：随机从净种子中数取100粒，重复8次，计算平均质量，标准差及变异系数。要求重复间变异系数小于4.0，测定值有效。(2)千粒法：随机从净种子数取1000粒，重复2次，计算平均质量，标准差及两重复间差数。要求2个重复间差数与平均数之比小于5%，测定值有效。

2.5 含水量测定

分别采用高恒温烘干法和低恒温烘干法测定每份种子样品含水量。(1)低恒温烘干法：在105 ℃条件下烘18 h后，计算种子含水量。(2)高恒温烘干法：在130 ℃高温条件下，分别烘1，2，3，4 h后计算种子含水量。每份称种子样品5 g，3次重复，要求每份样品2次测定之间差距不超过0.2%。

2.6 发芽率测定

2.6.1 发芽前处理 种子先用0.3%的高锰酸钾溶液浸泡10 min消毒，再用无菌水冲洗三遍，然后用以下方法进行发芽前处理：(a)种子未经任何处理，直接进行发芽试验；(b)种子采用5 ℃低温层积15 d后进行种子萌发试验；(c)种子采用5 ℃低温层积20 d后进行种子萌发试验；(d)种子采用5 ℃低温层积15 d后，再用100 mg·L-1GA3浸种30 h后进行种子萌发试验[5-7]；(e)种子采用5 ℃低温层积20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸种30 h后进行种子萌发试验；(f)种子直接用100 mg·L-1GA3浸种30 h后直接着床。以上种子以双层滤纸上做发芽床，在恒温20 ℃，湿度65%，无光照的培养箱中，进行种子萌发试验。每次100粒种子，3次重复。

2.6.2 发芽床的选择 试验样本经低温层积20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸种30 h后，选取滤纸，纱布，海绵，砂土4种发芽床试验。将种子分别置于不同发芽床，在20℃恒温，湿度65%，无光照条件下的人工气候箱中发芽。每次100粒种子，重复三次。

2.6.3 发芽温度的选择 试验样本经低温层积20 d后，再用100 mg·L-1GA3浸种30 h后，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃恒温和15～25℃变温，湿度65%，无光照的人工气候培养箱中发芽。每次处理100粒种子，3次重复。

2.6.4 发芽首次和末次计数时间 确定初次和末次发芽时间，记录下来。以胚根突出种皮长度超过种子直径一半时的天数作为初次计数时间。以种子萌发数达到最高，以后再无萌发种子出现时的天数作为末次计数时间。

2.6.5 发芽率和发芽势的测定 种子着床后在设定的条件下发出的芽到达种子长度的1/2时以此为标准判为发芽，种子发芽数与种子总数之比为发芽率。种子着床到16天时当天发芽的种子数达到最高峰，因此种子着床16天时为记录发芽势的时间。

2.7 生活力测定

TTC染色法为目前国际上公认的测定种子生活力较好方法[8]。将供试种子用清水预湿4 h，然后沿种脊将种子切成两瓣。使其露出胚乳，一半放入培养皿，切面向下，滴入TTC溶液浸没剖面，分别置于恒温箱中，避光条件下染色，观察并记录染色情况。每次处理100粒，3次重复，正交方法确定最优的种子染色方法。

2.8 种子生活力和种子发芽率相关性分析

发芽实验和生活力检验是种子质量检验的重要项目[9]，本研究拟通过探讨不同发芽条件用SPSS软件分析种子活力与种子发芽率之间的相互关系。

3 结果与分析

3.1 扦样

种子批的最大质量为2 000 kg，送验品最少为500 g，净度分析试样最少为50 g。

3.2 净度分析

4个产地的穿龙薯蓣种子净度测定结果见表1。产地A为吉林集安，产地B为辽宁抚顺，产地C为黑龙江伊春，产地D为辽宁鞍山。种子净度较高，达90%以上。使用此方法作净度分析，各试样增失差距均没有偏离原始质量的5%，此方法切实可行。

表1 不同产地穿龙薯蓣种子净度的测定

3.3 真实性鉴定

穿龙薯蓣种子四周有不等的薄膜状翅，全体略呈椭圆状肾形或长椭圆形，长8.9～14.1 mm，宽5.5～7.1 mm，厚0.5～0.9 mm，长约比宽大2倍[10]。种仁为椭圆行，呈深棕色，腹侧肾形凹入处下缘具点状种脐，由肿脐向一侧面伸出一棕色横线状种脊，膜质，深棕色至无色透明。胚白色，细小，胚芽明显，具子叶一枚，类似圆形，种子百粒重为0.5～1.3 g之间，千粒重为6.0～13.0 g之间。

3.4 质量测定

采用百粒重法和千粒法测定4个产地种子试样结果见表2。通过方差分析，采用2种方法测定4份种子试样的千粒重，各处理间无显著差异(P<0.05)，且数据重复间变异系数(或差数和平均数之比)均小于4.0，测定值有效，鉴于百粒法所需种子量较少，因此选用百粒重法。

表2 穿龙薯蓣种子不同质量测定方法比较

3.5 含水量测定

采用高恒温烘干法1，2，3，4 h对4个产地种子试样的含水量测定结果如图1。每产地取种子15 g，重复3次。采取高恒温烘干法，穿龙薯蓣种子在最初的2 h内迅速失去水分，随后失水缓慢，烘干3，4 h时，测得种子的含水量值趋于稳定，故选择适宜烘干时间为3 h。

图1 不同高温烘干时间下穿龙薯蓣种子的失水后质量

表3 穿龙薯蓣种子不同干燥方法的比较

本试验又对高恒温烘干3 h和低恒温烘干不同时间段测定的含水量进行统计分析，结果显示，高恒温烘干3 h和低恒温烘干17 h种子试样的含水量值无显著性差异，鉴于低温烘干法需要时间长，推荐使用高温干燥法烘干3 h。

3.6 发芽的测定

3.6.1 发芽前处理 为使试验结果更加准确，试验采用吉林通化种子发芽前处理试验。结果见图2及表4，结果显示低温层积20 d+GA3浸种30 h处理方法用时最少，发芽势最齐，发芽率最高，为最佳前处理方法。

表4 不同前处理方法对穿龙薯蓣种子发芽情况影响的比较

图2 穿龙薯蓣种子不同前处理方法比较

3.6.2 发芽床和发芽温度的选择 四个不同产区的穿龙薯蓣种子均已通过低温层积20d+GA3浸种30 h处理，四产区种子选用不同发芽床，不同温度时的发芽率和发芽势如表5。由下表可见穿龙薯蓣种子在砂土培养床上的发芽率和发芽势均为最好，其次是海绵发芽床，再次是滤纸培养床，最不好的是纱布培养床。穿龙薯蓣种子在温度20℃时为最佳发芽温度。故确定穿龙薯蓣种子发芽最佳条件为20℃时砂土培养床培养。

3.7生活力的测定

TTC浓度和染色时间分别进行单因素筛选试验，根据试验结果选取每个因素中的3个水平，采用L9(33)表安排正交试验，见表6及表7，以种胚的染色率为评价指标。每次处理100粒种子，重复3次[11]。

表5 不同产区穿龙薯蓣种子发芽床和温度的选择

表6 L9(33)正交试验结果

表7 正交试验方差分析

由以上L9(33)正交试验结果表可以看出影响因素的影响大小排序为B>A>C，由数据可知TTC浓度为最显著影响因素，其最佳染色条件为A2B2C3，即染色温度为45 ℃，TTC浓度为0.6%，染色时间为4.0 h时染色率最高，染色最快。根据正交试验方差分析结果显示TTC浓度的P<0.05，结果有意义。

3.8 种子生活力和种子发芽率相关性分析

选取温度为45℃，TTC浓度为0.6%，染色时间为4.0 h为染色条件来测定四个产地穿龙薯蓣种子的种子活力。选取20℃时砂土培养床培养为种子发芽条件。试验结果见表8。

表8 穿龙薯蓣种子生活力和种子发芽率

将TTC测定生活力的结果分别与相对应测定种子发芽率得到的结果进行相关性测验，相关系数r为0.994，P=0.006<0.05，具有显著性差异。表明TTC测定生活力得出的生活力值和种子发芽率有显著相关性，通过测定种子生活力也可以快速判定发芽[12]。进一步计算得发芽率Y对生活力X回归系数为b=1.058，回归方程为Y=-10.591+1.058X。

4 结论与讨论

农作物种子质量检验方法比较成熟，而大部分中药材种子还没有相应的国家检验标准和质量标准，无法对市场上的中药材种子质量进行检验和有效控制。因此，开展药用植物种子标准研究是我国中药材规范化生产急需解决的重要问题[13-14]。本试验从穿龙薯蓣种子扦样，净度分析，真实性鉴定，质量，含水量，发芽及生活力7方面对穿龙薯蓣种子质量检验方法进行了研究。确定了适宜穿龙薯蓣种子质量指标的检验方法。

不同产地穿龙薯蓣种子的生物学特性有一定差异，在建立种子质量检验方法时需考虑种子材料的代表性。本试验所用种子取自4个地区，能较好的代表生产上穿龙薯蓣药用用种子质量。

由种子生活力和种子发芽率相关性分析试验可知，TTC染色法测定的穿龙薯蓣种子生活力与发芽率存在极大的相关性。在生产和贸易过程中，运用生活力(X)与发芽率(Y)的回归方程Y=-10.591+1.058X，可以通过快速测定种子生活力，来预测穿龙薯蓣种子发芽率，在理论和实践上都有重要的作用[15]。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：250.

[2] 国际种子检验协会.国际种子检验规程[S].北京：中国农业出版社，1996.

[3] 中华人民共和国国家标准(GB/T3543-1995)[S].农作物种子检验规程[S].1995.

[4] 陈瑛.实用中药种子技术手册[M].北京：人民卫生出版社，1999.6.

[5] 陈瑛，等.植物药种子手册[M].北京：人民卫生出版社，1987：58.

[6] 孙昌高主编.药用植物种子手册[M].北京：中国医学科技出版社，1990：99.

[7] 张丽霞，李学兰，唐德英，等.阳春砂仁种子质量检验方法的研究[J].中国中药杂志，2011，36(22)：3086-3087.

[8] 郭巧生.药用植物栽培学[M].北京：高等教育出版社，2004.52.

[9] 张春庆，王建华.种子检验学[M].北京：高等教育出版社，2006：38.

[10] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1976：571.

[11] 刘志新，王博妍，权洪峰.宁夏道地药材银柴胡种子生活力等指标的测定[J].黑龙江医药，2010，23(5)：712.

[12] 吴德敏.用生活力预测种子发茅率相关性试脸研究[J].中国种业。2003(4)：31，33.

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[15] 罗光明，漆乐媛，杨雅琴，等.车前子种子生活力与发芽率的相关性研究[J].江西中医学院报，2011，23(2)：52.

TestingMethodsforSeedQualityofDioscoreanipponica

TU Xiu-wen1，YIN Hai-bo1，AN Ye2，CHEN Jing1，YAO Jia1，WANG Hong-cheng1*

(1.LiaoNingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China; 2.PharmacyDepartment，People'sLiberationArmyGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion，Shenyang110002，China)

Objective：To study the quality inspection method of the seed ofDioscoreanipponicaMakino，provide the basis for the development of testing procedures and quality standards.Methods：Refer to the international seed testing rules and the method of crop seed inspection procedures，test different regions seed quality content.Results：The submitted samples ofD.nipponicaseed is at least 500 g for purity analysis，and test samples at least 50 g；authenticity identification of seed by appearance shape comparison；quality determination by the hundred seed；water content determination by high temperature drying method for 3 h；before germination by 5 ℃ low temperature stratification about 20 d，and then use the method of 30 h 100 mg·L-1GA3 solution soaking，germination by 20 ℃ sand culture bed germination；TTC staining method was used for seed viability test，the dyeing temperature was 45 ℃，TTC concentration was 0.6%，dyeing time was 4 h.Seed germination rate(Y)was significantly correlated with seed viability(X)，and the regression equation wasY=-10.591+1.058X.Conclusion：The 7 indicators test method ofD.nipponicaseed have been preliminary established.7 indicators are：sampling，purity analysis，authenticity identification，quality，water content，germination rate and seed viability.

DioscoreanipponicaMakino；Seed；Quality testing methods；Vitality；Germination rate；Correlation

2013-04-11)

辽宁省教育厅项目(2009A498)；杏林青蓝工程杰出人才基金

*

尹海波教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药资源及药材的品质评价，E-mail：yhb0528@sina.com