不同产地猴耳环总黄酮含量比较研究△

陈明权，黄海波，赵径华

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

不同产地猴耳环总黄酮含量比较研究△

陈明权，黄海波*，赵径华

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

目的：测定不同产地猴耳环药材中的总黄酮含量。方法：以芦丁为对照品，三氯化铝(AlCl3)比色，采用紫外可见分光光度法(UV)测定样品总黄酮含量，检测波长406 nm。结果：总黄酮在5.09～50.90 μg·mL-1线性关系良好，回归方程为Y=0.026 7X+0.007 2，r=0.999 1；平均加样回收率为101.23%，RSD=1.93%(n=6)。结论：AlCl3比色法准确、简便，具有良好的重复性和稳定性，可用于猴耳环药材中总黄酮的含量测定；不同产地猴耳环中总黄酮的含量存在一定的差异。

猴耳环；总黄酮；含量测定

猴耳环药材来源于豆科含羞草亚科围涎树属植物猴耳环PithecellobiumclypeariaBenth.的干燥幼枝及叶，味苦、涩,性寒，具清热解毒、收湿敛疮功效，是治疗多种热毒症独特的南药[1]。现代临床主要用于治疗上呼吸道感染、急性胃肠炎、急性咽喉炎、急性扁桃体炎[2-4]；亦有明显的抗流感病毒作用，其中黄酮类成分为其主要成分之一[5]。然而，有关猴耳环中总黄酮的含量测定方法尚未见报道。实验通过紫外分光光度法测定不同产地猴耳环药材中总黄酮的含量，为建立猴耳环较完善的质量评价体系提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CARY 50 Probe紫外-分光光度计(美国瓦里安)；SCQ320ID超声波清洗仪(上海声彦超声仪器)；BP211D电子天平(德国赛多利斯)；DXF-10A粉碎机(广州市大祥电子机械设备)；800B离心机(上海安亭科学仪器)。

1.2 材料

9批猴耳环药材采集时间与地点，见表1，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为猴耳环PithecellobiumclypeariaBenth.的干燥幼枝及叶，标本存于广州中医药大学；芦丁对照品(批号：100080，中国食品药品检定研究院)；水为蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

表1 猴耳环药材样品来源

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芦丁对照品5.09 mg，置于50 mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液(0.101 8 mg·mL-1)。

2.2 测定波长的选择

精密量取2.0 mL芦丁对照品溶液，于10 mL 量瓶中，分别加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液(用70%乙醇配制)2 mL，摇匀，放置 6 min；加入pH 5.2的NaAc-HAc缓冲溶液1 mL，以70%乙醇稀释至刻度，并在水浴40 ℃加热15 min。以相应的试剂溶液作参比，按紫外分光光度法[6]，在350～600 nm扫描，结果表明芦丁对照品溶液在406 nm处有最大吸收，因此选择406 nm为测定波长。

2.3 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分别置于10 mL 容量瓶中，分别加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液2 mL，摇匀，放置6 min；加入pH 5.2的NaAc-HAc缓冲溶液1 mL，以70%乙醇稀释至刻度，并在水浴40 ℃加热15 min，以相应的试剂溶液作空白，测定吸光度。并以吸光度为纵坐标(Y)，浓度(μg·mL-1)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y=0.026 7X+0.007 2，r=0.999 1(n=6)。

2.4 供试品溶液的制备

精密称取各产地猴耳环细粉约1.00 g，置入100 mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，立即盖上瓶塞，称定重量，超声处理40 min，冷却，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，离心(2 000 r·min-1，10 min)，过滤，取续滤液作为猴耳环供试品溶液。

2.5 精密度试验

精密吸取2 mL芦丁对照品溶液，按2.3项下方法测定吸光度，连续测定6次；所测结果代入标准曲线方程计算浓度，其均值为20.26 μg·mL-1，RSD=0.23%(n=6)，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

取猴耳环样品平行操作6份(广东罗定样品)，精密量取0.2 mL供试品溶液于10 mL量瓶中，按2.3项下方法测定吸光度，计算猴耳环总黄酮的含量。结果求得其RSD=1.47%(n=6)。表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取猴耳环供试品溶液(广东罗定样品)，精密量取0.2 mL供试液于10 mL量瓶中，按2.3项方法，分别在10，20，30，40，50，60 min 测定吸光度，所测结果代入标准曲线方程计算浓度，求得其RSD=1.43%(n=6)，表明供试品溶液在60 min内显色基本稳定。

2.8 加样回收试验

取同一批已知含量的供试品(广东罗定样品，总黄酮含量为0.96%)6份，精密称量约0.50 g，加入一定量芦丁对照品，按2.3项下方法操作；取本品的供试液0.2 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，作参比，测定吸光度，计算回收率，结果见表2，表明氯化铝比色法的加样回收率良好。

表2 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定

精密吸取上述各产地供试液0.2 mL，置于10 mL量瓶中，按2.3项下方法操作；取本品的供试液0.2 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，作参比，在406 nm波长处测定吸光度。求各产地猴耳环中总黄酮的含量，结果见表3。

表3 不同产地猴耳环中总黄酮的含量测定结果(n=3)

结果表明，不同产地总黄酮含量大小依次为：海南尖峰岭>海南霸王岭>广东惠东>广东从化>云南西双版纳>广东新兴>广西百色>广东罗定>广东信宜，经统计分析，各产地猴耳环药材中总黄酮含量存在显著差异。海南尖峰岭猴耳环药材总黄酮含量最高，达2.39%；广东信宜猴耳环药材总黄酮含量最低，仅为0.36%。

3 讨论

关于总黄酮的测定方法报道较多，一般采用比色法、高效液相色谱法。比色法以NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法常用[7]，郭亚建等[8]曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现有些黄酮类物质在500 nm处无最大吸收或吸收很弱，而有些具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在500 nm处有最大吸收或有较强吸收。而猴耳环药材中所含有机酸成分均具有邻二酚羟基[5，9]，因此，使用该方法测定结果的专属性不强，有局限性。据文献报道[10]，AlCl3比色法主要是依据具有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基的黄酮与Al3+形成配合物使吸收峰红移的性质，测定总黄酮含量；猴耳环药材中的3种黄酮均具有发生该反应的结构，故采用三氯化铝比色法测定猴耳环药材中总黄酮含量具有相对较强的专属性。

实验选择了专属性较强的AlCl3比色方法，方法学考察试验显示该法稳定性好、重现性好、精密度高、回收率好。可见，该法测定总黄酮含量，操作简单方便，结果比较准确，既可用于猴耳环药材的质量控，又可为其进一步开发利用提供参考。

[1] 陈元胜，叶永才.广东省中药材标准[M].第一册.广州：广东科学技术出版社，2004：197-199.

[2] 兰小玲，黄跃，杨广林.猴耳环消炎片治疗咽喉炎、扁桃腺炎200例疗效观察[J].实用临床医学，2007，8(2)：89-90，92.

[3] 陈洪林.猴耳环消炎颗粒治疗急性咽炎52例临床观察[J].新余高专学报，2010，15(2)：97-98.

[4] 王家蔚，郁峰.猴耳环消炎颗粒治疗急性上呼吸道感染疗效观察[J].实用中西医结合临床，2011，11(3)：64-65.

[5] 李药兰，李克明，苏妙贤，等.猴耳环抗病毒有效成分研究[J].中国中药杂志，2006，31(5)：397-400.

[6] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录30-31.

[7] 马陶陶，张群林，李俊.中药总黄酮的含量测定方法[J].安徽医药，2007，11(11)：1030-1032.

[8] 郭亚健，范莉，王晓强，等.关于NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志，2002，22(2)：97-99.

[9] 郭晓宇，王乃利，宝丽等.猴耳环的化学成分及其对T淋巴细胞增殖的影响[J].中国药学(英文版)，2007，16(3)：208-213.

[10] 马陶陶，张群林，李俊，等.三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨[J].时珍国医国药，2008，19(1)：54-56.

ComparisonStudyofTotalFlavonoidsinPithecellobiumclypeariaBenthfromDifferentProducingAreas

CHEN Ming-quan，HUANG Hai-bo*，ZHAO Jing-hua

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou510006，China)

Objective：To determine the content of total flavonoids inPithecellobiumclypeariaBenth from different habitats，according to the content level to clustering analysis of it.Methods：Rutin was defined as the reference substance，using AlCl3colorimetry and UV-Vis spectrophotometry method was adopted.the detective wavelength was 406 nm.Results：Concentration of total flavonoids had a good liner relationship in the range of 5.09～50.90 μg·mL-1.The regression equation wasY=0.026 7X+ 0.007 2，r=0.999 1.The average recovery rate was 101.23% with RSD 1.93%(n=6).Conclusion：The method is simple，specific，repeatable and stable.It can be applied for the quantitative determination ofPithecellobiumclypeariaBenth.The contents of total flavonoids were significantly different in different producing areas ofPithecellobiumclypeariaBenth.

PithecellobiumclypeariaBenth；Total flavonoids；Quantitative determination

2013-06-01)

基于多学科的南药开发利用关键技术集成示范研究(2012BAI29B09)

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黄海波，副教授，主要从事中药材质量标准规范化研究与中药材GAP研究，E-mail：bobhwang65@gmail.com