3种中药注射液突变选择窗的测定

李 虹，叶 云，王国俊△

（1.四川省乐山市人民医院药剂科 614000；2.泸州医学院附属医院药剂科，四川泸州 646000）

近年来，细菌耐药相关研究备受关注，1999年有研究小组提出防突变浓度（mutant prevention concentration，MPC）和突变选择窗（mutant selection window，MSW）理论［1］，MPC是指防止第一步耐药突变株被选择性富集扩增所需的最低抗菌药物浓度。最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）与 MPC之间的浓度范围定义为MSW。MSW相关理论认为：只有药物浓度在野生型药物敏感菌的 MIC和 MPC之间即在 MSW内时，耐药突变菌株才被选择性扩增。当药物浓度低于MIC时，由于它可使整个病原菌群增强，没有选择压力而不会导致耐药突变菌株被选择。当药物浓度高于 MPC时，由于细菌必须同时产生两种或两种以上耐药突变才能生长，因此也不会有耐药突变菌株被选择出来。这一理论为解决抗菌药物的耐药问题提供了新思路。关于 MPC和 MSW的研究，目前主要集中在氟诺酮（fluoorquinolone，FQ）类等西药抗菌药物对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、结核分支杆菌、非结核分支杆菌等的体外实验研究［2-4］。虽然大量文献报道中药具有抑菌作用［5-7］，但相关研究主要集中在对中药及其制剂的 MIC的测定［8］，对其 MPC、MSW的研究目前尚未见相关报道。

本文拟体外测定3种中药注射液的MIC、MPC、MSW，探讨中药注射液抑制金黄色葡萄球菌耐药突变菌株选择能力，为中药在抗感染性疾病方面的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 金黄色葡萄球菌ATCC29213，中国药品生物制品检定所。

1.1.2 培养基 营养肉汤培养基（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：100804）；MH琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：100804）。

1.1.3 药物 大蒜素注射液 （徐州莱恩药业有限公司，2mL：30mg，批号：1008261）；双黄连粉针（哈药集团中药二厂，600 mg／支，批号：1003015）；喜炎平（江西青峰药业有限公司，2 mL：50mg，批号：20101115）。

1.1.4 实验仪器 CO2培养箱（HH.CP-01，上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取多个菌落接种于含10mL营养肉汤的试管中，并标记为管A，置于孵育箱中24h。24h后，拿出管A并采用活菌计数法对管A中金黄色葡萄球菌进行计数。将管A摇匀后，取20μL，经5次10倍稀释后，取最后一个稀释度的菌液20μL均匀的涂布在血平皿上，同法做4个平行对照。并标记为1、2、3、4。将4个血平皿放入37℃的培养箱中培养24h，长出菌落后，计数，并根据最后的平均结果推算出原菌液的含菌数。此时管A中金黄色葡萄球菌的数目约为2×1012CFU／mL。将已知菌落数的管A经一系列稀释后，将菌液稀释于试管中调整为6×105CFU／mL，并标记为管B，将管A、B置于4℃中冷藏保存。

1.2.2 MIC的测定 采用标准琼脂2倍稀释法，分别测定双黄连粉针、喜炎平注射剂、大蒜素注射剂3种中药注射液对金黄色葡萄球菌的MIC，每一浓度设6个平行对照。阴性对照组为未加药物的培养基。阳性对照组按参考文献进行配制（测定MIC的阳性对照组的药物浓度为0.13μg／mL的左氧氟沙星）［9］。倍比递增药物浓度，配制含双黄连粉针、喜炎平注射液、大蒜素注射液的几个浓度梯度的MH琼脂平板。取20μL管B中细菌均匀涂抹在各含药平皿上，使MH琼脂上接种菌量为1.2×104CFU，用L形棒均匀涂布，并绕壁2圈。每个浓度6个平皿，根据CLSI 2005年标准进行判读结果。37℃培养24h后观察结果，以平板上无菌生长的最低药物浓度定为MIC。

1.2.3 MPC的测定 采用标准琼脂2倍稀释法分别测定双黄连粉针、喜炎平注射剂、大蒜素注射剂3种中药注射液对金黄色葡萄球菌的MPC，每一浓度设6个平行对照。阴性对照组为未加药物的培养基。阳性对照组按参考文献进行配制（测定MPC的阳性对照组的药物浓度为1.3μg／mL左氧氟沙星）［9］。以MIC为基准，倍比递增药物浓度，制备几个浓度梯度的含不同药物浓度的MH琼脂平皿。取20μL管A菌液均匀涂抹在各含药平皿上，并绕壁2圈，每个药物浓度用6个平皿，使每个药物浓度平皿的细菌总接种量为1.2×1010CFU。并置于培养箱中37℃孵育，24、48、72h后观察各平皿中金黄色葡萄球菌的生长情况，孵育72h后仍无细菌菌落生长的最低药物浓度为暂定MPC（MPCpr），再以 MPC（MPCpr）为基准线性增减20%，重复MPCpr的测定步骤，每浓度作6个平皿，以平皿中不出现菌落生长的最低药物浓度即为MPC。对接近MPC药物浓度筛选出来菌株接种无药物的琼脂平板上，传代2次后再接种于原筛选药物浓度的平板上，以确保其是耐药突变株。

1.2.3 MSW和SI的计算 药物MIC和MPC之间的范围即为MSW。药物的MPC与MIC的比值（MPC／MIC）即为药物选择指数SI。

2 结 果

2.1 MIC的测定 结果表明：双黄连粉针的MIC为1.905 mg／mL，喜炎平注射剂的 MIC＞1.000mg／mL，大蒜素注射剂的MIC为5.960×10-3mg／mL。见表1。

表1 3种中药注射液对金黄色葡萄球菌的MIC（n=6）

2.2 MPC的测定 结果表明：双黄连粉针MPC为14.737 mg／mL；喜炎平注射剂的 MPC＞15.385mg／mL；大蒜素注射剂MPC为3.850×10-2mg／mL。见表2。

表2 3种中药注射液对金黄色葡萄球菌的MPC（n=6）

续表2 3种中药注射液对金黄色葡萄球菌的MPC（n=6）

2.3 3种中药注射液的MSW及SI 结果表明：双黄连粉针和大蒜素注射剂的SI值相差不是特别大，并且两种中药制剂的SI都小于左氧氟沙星，从小到大依次为：大蒜素注射液小于双黄连粉针小于左氧氟沙星。见表3。

表3 3种中药注射液的MSW及SI

3 讨 论

随着加入的喜炎平注射液越多，琼脂板变得越来越柔软，在接种细菌时很容易使其破裂，所以未制作含更大浓度的喜炎平注射液的琼脂平板进行MIC和MPC值的测定。本研究表明，大蒜素注射液、喜炎平注射液、双黄连粉针对金黄色葡萄球菌ATCC29213均有不同作用的抑制作用，其抑菌能力为大蒜素注射液大于双黄连粉针大于喜炎平注射液。李朝霞等［10］测定了6种不同抗菌药物左氧氟沙星、阿奇霉素、利福平、万古霉素、妥布霉素、氯霉素对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC和 MSW。它们的 MIC分别为0.125、1.0、0.002、0.5、3.0、0.5μg／mL；MPC分别为1.4、51.2、＞1 024、4.8、16、16 μg／mL。这6种抗菌药物对金黄色葡萄球菌的MSW差异很大，以利福平的MSW最宽（SI＞512 000），氯霉素的 MSW最窄（SI=5.3）。比较而言，以上3种中药制剂对金黄色葡萄球菌ATCC29213的MIC值均明显高于西药抗菌药物，表明其抗菌作用弱于西药抗菌药物，但双黄连粉针及大蒜素注射液对金黄色葡萄球菌的选择指数均较低，且明显低于阳性对照组的左氧氟沙星，说明上述中药制剂限制耐药突变菌株选择的能力较强，提示某些中药在对抗细菌耐药方面可能发挥其独特的优势。而大蒜素注射液的MIC及MPC值远小于双黄连的MIC及MPC值，提示大蒜素注射液对金黄色葡萄球菌的抑菌能力比较强。大蒜素较强的抑菌作用可能是因为其具有独特的药理活性——容易透过磷脂膜和红细胞膜进入细胞内，从而与一些截留化合物相互作用，实现其药理价值［11］。

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