KLF4对人胃癌细胞株SGC-7901体外增殖及迁移侵袭能力的影响＊

黄 镇，王子卫△，张 能，查 郎，吴 钊

（1.重庆医科大学附属第一医院胃肠外科，重庆 400016；2.四川大学华西第二医院妇产科，四川成都 610041）

肿瘤是世界范围内严重的公共卫生问题，在美国，每年有1／4的死亡由恶性肿瘤所致［1］，而作为最常见的上皮源性恶性肿瘤和主要的肿瘤致死性相关疾病，全球每年有12%的肿瘤患者死于胃癌［2］。虽然手术切除是胃癌治疗的首选方案之一，特别是早中期胃癌［3］，然而，由于肿瘤细胞侵袭转移，治疗常常十分棘手。胃癌的侵袭转移涉及一系列分子水平的异常，Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是近年来新发现的一种细胞生长抑制因子，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等多种生理、病理过程的调控［4］。本课题组前期研究发现在胃癌组织中KLF4低表达，明显低于癌旁及正常组织，并且其阳性表达与肿瘤浸润层次和淋巴转移相关［5］。本实验选用人胃癌SGC-7901细胞株，转染KLF4基因，进一步探讨KLF4对胃癌细胞的生物学行为及功能的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与质粒 人胃癌SGC-7901细胞株由重庆医科大学附属第一医院实验研究中心备存。pcDNA3.1-IRES-EGFP真核质粒载体购于北京泛基诺科技有限公司，pcDNA3.1IEKLF4重组真核质粒载体由北京泛基诺科技有限公司协助构建。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基、OPTI-MEMⅠ培养基、G418购于美国Gibco公司，新生小牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于美国Sigma公司，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）购于北京中杉金桥生物技术有限公司，胰蛋白酶和脂质体Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit、Premix Taq购于大连TaKaRa公司，DNA marker购于北京天根生化科技有限公司；Transwell小室（8μm孔径）和人工基质胶Matrigel购于美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人胃癌SGC-7901细胞株呈贴壁生长，培养于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱。倒置光学显微镜下观察细胞生长情况。0.1%胰蛋白酶消化、收集细胞，按1∶2～4传代。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.2 构建真核表达载体pcDNA3.1IE-KLF4 pcDNA3.1-IRES-EGFP载体可表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），并具有对新霉素（neomycin）的抗药基因，其产物可将G418转化为无毒形式。pcDNA3.1IE-KLF4重组真核载体由北京泛基诺科技有限公司协助构建；将KLF4基因连接到上述载体的BamHⅠ／EcoRⅠ位点，对pcDNA3.1IE-KLF4最终载体行酶切和测序鉴定，证实构建成功。

1.3.3 脂质体介导转染并建立KLF4稳定过表达细胞株将细胞分为未转染组、pcDNA3.1-IRES-EGFP转染组（即空载体组）、pcDNA3.1IE-KLF4转染组（即转染组）。转染前1d，胰蛋白酶消化、收集细胞，接种于6孔板，每孔细胞2×105个，37℃、5%CO2培养至约60%汇合。每孔质粒（μg）与脂质体（μL）按1.0∶2.5配制转染复合液，分别加入上述各组并轻轻混匀，OPTI-MEMⅠ培养基补足至2mL。6h后，更换为正常培养基继续培养。24h后观察转染情况，成功转染的细胞表达GFP，因而可被激发出绿色荧光，使细胞在荧光倒置显微镜下呈现为绿色。48h后，根据预实验测定的最佳浓度行G418筛选（350μg／mL）。10～14d后，挑取单个克隆，以G418维持浓度（250μg／mL）扩大培养以获得稳定转染细胞株供后续实验所用。

1.3.4 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测各实验组KLF4mRNA的表达实验分组同前。取各实验组对数生长期细胞，按RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA，经紫外分光光度仪定量RNA浓度和纯度，并逆转录合成cDNA。逆转录条件：37℃逆转录15min，85℃逆转录酶失活5s。扩增引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，序列如下：KLF4上游引物：5′-CTT CCT GCC CGA TCA GAT GC-3′，下游引 物：5′-CGG TAG TGC CTG GTC AGT TCA-3′，产物大小298bp；GAPDH 上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，产物大小476bp。扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像分析仪观察拍照，Quantity One软件分析图像。

1.3.5 四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测各实验组细胞增殖能力 胰蛋白酶法收集上述各实验组对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5×104／mL，接种于96孔板（200μL／孔），每组设8个平行复孔。分别在接种后0、24、48、72h，每孔加入 MTT溶液（5mg／mL）20μL；常规培养4h后，弃上清液，加入DMSO（200μL／孔），振荡10min使结晶物充分溶解。空白调零后，酶标仪检测570nm波长处的吸光度（Absorbance，A）值。细胞增殖抑制率的计算公式：抑制率=（1-实验组A570／对照组A570）×100%。

1.3.6 划痕试验检测细胞迁移能力 按上述方法收集各组细胞接种于6孔板中（1×106／孔）。待细胞生长汇合成单层细胞后，用无菌的中号移液器枪头在细胞层上小心地行“一”字形划痕，PBS清洗2次，倒置显微镜下观察划痕处无悬浮或游离的细胞。分别在0、24、48h观察并拍照各组划痕愈合程度（反映细胞迁移能力），细胞迁移率的计算公式：迁移率=（1-48h划痕距离／初始距离）×100%。

1.3.7 Transwell小室检测细胞侵袭能力 用无血清RPMI 1640培养基稀释Matrigel基质胶至5mg／mL，取40μL加到Transwell小室膜上，37℃孵育使其凝固，紫外灯照射消毒过夜。实验前加入30μL无血清RPMI 1640培养基水化基底膜（37℃，30min）。收集各实验组细胞，用无血清RPMI 1640培养基调整细胞密度为5×105／mL，于上室中加入此细胞悬液400μL，下室中加入含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基600μL，常规培养。24h后，取出小室，用棉签小心擦去上层细胞和基质胶，并用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性树胶封片。每张片随机选取5个视野进行细胞计数并拍照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 转染效率的测定 转染24h后，荧光倒置显微镜观察，成功转染的细胞因表达GFP而被激发出绿色荧光，在镜下呈现出绿色，见图1。

2.2 转染后各组细胞KLF4mRNA的表达 结果见图2所示，在pcDNA3.1IE-KLF4转染组中可见明显扩增的KLF4基因片段，长度为298bp，而其他两组中相应位置几乎未见相应条带或表达极低，因此，可以认为转染成功，转染组细胞中有KLF4mRNA的表达，见图2。

2.3 MTT法测定各组细胞的生长增殖情况 MTT法检测结果见表1。在各时间观察点，未转染组与空载体组细胞的A570值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。24h时，转染组细胞A570值较对照组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；在48h和72h，转染组细胞A570值明显低于未转染组和空载体组（P＜0.05）。以对照组作为参照，24、48、72h转染组的细胞增殖抑制率分别为12.90%、23.85%、25.56%。

图1 转染24h后的SGC-7901细胞（荧光倒置显微镜 ×200）

2.4 划痕试验检测细胞体外迁移能力 划痕48h后，未转染组和空载体组细胞的迁移率分别为（78.15±4.86）%、（73.75±4.03）%，二者之间差异无统计学意义（P＞0.05）；转染组细胞的迁移率为（60.84±5.56）%，较对照组下降（P＜0.05），见图3。

2.5 Transwell小室检测细胞体外侵袭能力 侵袭试验结果显示，未转染组和空载体组的侵袭穿膜细胞数分别为（163.53±13.95）个、（158.07±12.54）个，组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转染组的侵袭穿膜细胞数为（73.87±8.70）个，较对照组明显减少（P＜0.05），见图4。

图2 RT-PCR检测各组细胞KLF4mRNA的表达

表1 不同时间点KLF4mRNA对SGC-7901细胞增殖的影响（，%，n=3）

表1 不同时间点KLF4mRNA对SGC-7901细胞增殖的影响（，%，n=3）

a：P＜0.05，与未转染组比较；b：P＜0.05，与空载体组比较。

组别0h 24h 48h 72h未转染组 0.283 6±0.283 6 0.377 2±0.077 5 0.468 0±0.098 40.528 7±0.080 4空载体组 0.285 0±0.057 4 0.385 1±0.069 8 0.459 4±0.064 7 0.513 1±0.067 6转染组 0.287 5±0.062 0 0.312 9±0.103 0 0.353 1±0.057 6ab 0.387 7±0.029 0ab

图3 划痕试验检测KLF4对SGC-7901细胞迁移能力的影响（倒置显微镜×100）

3 讨 论

胃肠道是一个开放的系统，其黏膜上皮一方面受到机械、化学以及生物因素等的侵袭而损伤脱落；另一方面，其上皮细胞通过增殖、分化、迁移以不断更替，因此，胃肠道上皮处于损伤和抗损伤的动态平衡中。若此过程中某因素发生改变或调节失控，则可能导致正常细胞恶性转化。作为最常见的肿瘤之一，胃癌的发病机制尚不明确，其发生、发展与多种因素相关。虽然已有手术、放疗、化疗等多种治疗手段，但其治疗常常因肿瘤细胞的侵袭转移而失败。KLF4是KLF家族中的重要成员之一，其羧基端的3个锌指结构，为该家族特征性结构［6］。KLF4主要表达于胃肠道上皮、皮肤、血管内皮和胸腺，并且主要在上皮细胞分化末期、有丝分裂后期表达［7］，因此，也称为胃肠富集KLF或上皮锌指蛋白。人类KLF4基因位于9q31，有5个外显子，其cDNA全长1 440bp，编码产物为含有479个氨基酸残基的蛋白。

KLF4与多种生命活动相关，包括生长、发育、增殖、分化等。研究表明，在胚胎发育晚期及肠管分化终末期的上皮细胞中KLF4表达均增高，在生长抑制的状态下亦明显增高，提示KLF4可抑制某些细胞的增殖，对调节上皮细胞分化有重要作用［8］。细胞的增殖依赖于细胞周期完整、有序地进行，而KLF4作为一种细胞生长抑制因子，一方面抑制Cyclin D1、鸟氨酸脱羧酶等细胞周期正性调节基因的启动子，下调它们的表达；另一方面，KLF4还可诱导P21、P27、P53等细胞周期负调控因子表达，阻滞细胞G1期向S期转化，从而抑制细胞增殖［9-10］。Ghaleb等［11］发现，有条件地敲出 KLF4基因后，缺陷小鼠小肠上皮细胞的增殖和迁移得到上调，并伴有肠绒毛刷状缘分泌因子的改变和潘氏细胞异位；而在结肠，则伴有碳酸酐酶的减少和杯状细胞的分化与成熟障碍。研究证实KLF4与多种肿瘤密切相关，其中膀胱癌、前列腺癌、食管癌、结直肠癌、胃癌等肿瘤中KLF4表达降低，而在乳腺导管癌和口腔鳞癌中KLF4表达上调。Xu等［12］研究发现，采用DNA去甲基化制剂5-氮-2′脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC）处理结肠癌SW620、RKO细胞系后，KLF4表达上调，提示KLF4在结直肠腺瘤和癌中的极度低表达可能与表观遗传学的调控有关，启动子区异常甲基化降低了KLF4的表达。该研究还发现，虽然KLF4的表达情况与结直肠癌患者的总体预后无明显关联，但是对于已有淋巴结转移的结直肠癌患者，KLF4阳性表达者的预后优于阴性表达者。

Wnt（wingless and int-1）／β-链蛋白（β-catenin）信号通路与正常组织发育和多种疾病的发生、发展密切相关，在肿瘤演变中亦起着极为重要的作用；该通路涉及β-catenin、结肠腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）因子、T细胞因子4（T cell factor 4，TCF-4）、淋巴增强因子（lymphoid enhancer factor，LEF）等参与，β-catenin是其中最重要的因子之一［13］。KLF4可直接与β-catenin转录活化区结合，下调β-catenin表达，并抑制其介导的转录［14］，提示 KLF4不仅是 Wnt／β-catenin信号通路中的重要成员，而且在此通路中发挥抑制作用。另外，KLF4还是一种干细胞相关因子，慢病毒介导联合转染八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor-4，Oct-4）、性别决定区Y框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX-2）、C-MYC及KLF4可诱导正常体细胞向多能干细胞转化，进而发生增殖、分化、转移的改变［15］。

侵袭转移是恶性肿瘤的特性之一，亦是肿瘤恶性进展的关键步骤。在此过程中，肿瘤细胞无限增殖是前提，而肿瘤细胞同质黏附降低和异质黏附增强，使得肿瘤细胞更易脱落，并降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），迁移至邻近组织，进而发生远处转移。本研究以质粒为载体将KLF4基因成功转入胃癌SGC-7901细胞，RT-PCR证实转染细胞中KLF4 mRNA表达水平明显提高。MTT显示转染KLF4基因后，细胞增殖下降，与此前另一研究方法结果一致［16］。划痕试验和Transwell小室试验显示转染组细胞迁徙侵袭能力下降，其机制可能与 KLF4与β-catenin相互作用有关［14，17］，而β-catenin不仅是重要的细胞连接和黏附因子，亦是 Wnt／β-catenin信号通路中的核心成员之一。上皮细胞间质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）参与了肿瘤侵袭转移，沉默KLF4将会导致上皮细胞在形态和迁移方面发生变化，与此相伴的是上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）丢失，而KLF4表达上调后能明显恢复E-cadherin的表达，同时抑制癌细胞的侵袭和转移［18］。本研究显示KLF4表达上调后，胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力发生改变，提示KLF4可能成为胃癌分子治疗的潜在靶点，至于其中的机制，特别是KLF4与β-catenin、E-cadherin之间如何相互作用，是否还有其他因子参与，将会是笔者后续研究的重点。

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