酸度对叶酸荧光强度影响的设计实验

王玉芹 丁益民 曹志源 饶薇薇 张慧

(上海大学理学院化学系 上海 200444)

仪器分析课程是我系应用化学专业的专业必修课，与之相配套的实验课可以使学生将理论知识与实践紧密地结合起来，建立起严格的量的概念。在仪器分析实验内容的选定上，我们不断补充新的知识，如催化动力学、荧光分析、化学发光分析等，使学生及时了解目前有关分析法的前沿知识、发展动态和新的分析手段。在教学中，我们不断引入新的知识内容，及时更换实验讲义，目的不仅是要使学生学会仪器分析方法、掌握大型仪器的基本操作技能，而且还要提高学生运用所学知识分析、解决实际问题的综合能力。

叶酸(folic acid)是一种广泛存在于绿色蔬菜中的B族维生素，在人体内参与氨基酸及核酸的合成，并能与维生素B12共同促进红细胞的生成。国外研究人员发现，叶酸可引起癌细胞凋亡，对癌细胞的基因表达有一定影响[1-2]。

本实验的设计是在结合荧光分析法的基础上，引入目前较受关注的叶酸，以激发学生的实验兴趣。通过本实验，学生不仅可以掌握荧光分光光度计的测试原理和基本操作，还可以学习荧光分析法在实际生活中的应用，从而更加有利于实验教学的开展和增强学生的学习效果。

1 实验设计目的

(1) 学习配制不同pH的缓冲溶液。

(2)了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。

(3) 了解荧光光谱测试的影响因素，并用标准曲线法定量分析保健品中的叶酸含量。

2 实验原理

2.1 荧光的测试原理

荧光光谱法是利用物质吸收可见-紫外光成为激发态而又去活化过程(返回到原来基态的过程)发生的光辐射现象。荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱，它们是荧光定性分析的基础。溶液的荧光测量是在与激发光垂直的方向进行的，图1为荧光分光光度计的结构示意图。

图1 荧光分光光度计结构示意图

荧光定量分析的数学处理比分子吸收光谱复杂。一般来讲，荧光强度If等于分子所吸收辐射的光强度Ia与量子效率φ的乘积，即If=φf·Ia=φf·I0(1-10-εbc)。如果荧光物质的浓度足够低，则If=2.3φf·I0εbc=kc(式中ε、b、c分别是摩尔吸光系数、比色皿厚度及被测物质的浓度)。这表明被测物质的浓度与荧光强度成正比，这就是荧光定量分析的理论基础。

2.2 叶酸的荧光性能

叶酸微溶于水，其钠盐在水中溶解度较大；叶酸在中性及碱性溶液中比较稳定，在酸性溶液中加热易分解。叶酸稀溶液的荧光比较弱，直接测定灵敏度不高。在浓度为1×10-4～1×10-5mol·L-1的水溶液中，叶酸的最大激发光谱为365nm，最强发射峰位于449nm。在入射和出射狭缝均为5nm时，浓度为1×10-4mol·L-1的叶酸水溶液的激发和发射光谱见图2。

图2 叶酸水溶液的激发和发射光谱

据报道[3]，叶酸与高锰酸钾反应生成强荧光产物喋呤(C7H4N5O3),其荧光强度比叶酸大很多。叶酸光照后的荧光强度变化情况与此类似,在中性和弱碱性介质环境中、紫外线作用下会发生光化学发应，生成了强荧光喋呤类物质，主要成分是喋呤-6-羧酸和喋呤-6-甲醛(图3)。因此可以通过荧光灯照射的方法增强叶酸荧光强度，提高实际样品中叶酸含量分析的灵敏度。

图3 叶酸生成强荧光喋呤类物质的反应

3 实验内容

3.1 仪器

RF-5301PC荧光分光光度计(岛津)，pH计，电子天平，手持荧光灯，容量瓶，棕色玻璃瓶，烧杯，移液管。

3.2 试剂

叶酸(BR)，磷酸氢二钠(AR)，磷酸二氢钾(AR)，氢氧化钠(AR)，铁质叶酸片(安利纽崔莱)。

3.3 实验步骤

3.3.1 缓冲溶液的配制

A液：0.0667mol·L-1磷酸氢二钠(Na2HPO4)溶液的配制。准确称量9.465g磷酸氢二钠，用高纯水溶解，定容于1000mL容量瓶中。

B液：0.0667 mol·L-1磷酸二氢钾(KH2PO4)溶液的配制。准确称量9.070g磷酸二氢钾，用高纯水溶解，定容于1000mL容量瓶中。

将A，B液分别保存在棕色玻璃瓶中，冷藏于4℃冰箱中，使用时按不同比例混合，利用pH计测量，即可得到不同pH的PBS缓冲溶液[4](表1)。

表1 PBS缓冲溶液的配制

3.3.2 叶酸溶液的荧光测试

(1) 将叶酸分别溶解在pH为5.91、7.38和8.04的PBS缓冲溶液中，配制出3种浓度为1×10-4mol·L-1叶酸溶液，避光静置30min后，测试其荧光发射光谱。

(2) 在暗处用发射波长为365nm的荧光灯(中心波长滤色片为150mm×50mm，功率为8W)照射上述3种pH的叶酸溶液1h，再避光静置30min，分别测试其荧光发射光谱。

3.3.3 标准曲线法定量分析叶酸含量

(1) 叶酸标准溶液(2mg·L-1)的配制：准确称取2mg叶酸标准品，加入几滴0.1mol·L-1氢氧化钠溶液助溶于烧杯中，充分溶解后转移至容量瓶，用蒸馏水定容至1000.00mL。准确吸取0.00(空白样)，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00mL叶酸标准溶液，分别置于10.00mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。在暗处用发射波长为365nm的荧光灯照射上述叶酸溶液1h，在Ex=365nm，Em=449nm处测定荧光强度。以荧光强度为纵坐标，叶酸的含量为横坐标，绘制标准曲线。

(2) 待测样品的配制：取0.3g研细的铁质叶酸片样品(约含叶酸66μg)，加入几滴0.1mol·L-1氢氧化钠溶液于烧杯中，再转移至容量瓶中,用蒸馏水定容至50.00mL。准确吸取5.00mL样品母液，置于10.00mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，得到待测样品溶液。

(3) 待测样品的测定：用发射波长为365nm的荧光灯暗处照射待测样品溶液1h后，在Ex=365nm，Em=449nm处测定样品的荧光强度，在标准曲线上找出对应的含量，以此求出铁质叶酸片中的叶酸含量。

4 数据处理

(1) 分别标出3种pH下叶酸荧光光谱的波长。

(2) 用荧光灯照射后，记录3种叶酸溶液的荧光峰位置和强度的变化。

(3) 根据仪器所绘标准曲线，记录待测样品溶液的浓度，并计算铁质叶酸片中叶酸的含量。

5 实践情况

5.1 课程安排

(1) 本实验项目被编入冬季仪器分析实验讲义，只对化学系具有一定实验技能的高年级学生开放，为自愿选修实验。

(2) 本实验设为8课时，分成仪器培训和实践操作两部分，一般为6～8个学生一组进行。

5.2 实践效果

经过2009和2010两个学年的实践证明，学生都已具有理论及基础实验课程的知识积累，对于大型精密仪器的引入颇感兴趣，学习和操作的积极性较高。

(1) 在仪器培训阶段，通过实践学习，能够熟练操作仪器的学生在课后可以申请进行考核，经教师确认其已具有独立操作能力后，颁发操作证。有样品测试要求的学生凭操作证即可预约时间自行测试。

(2) 在配制溶液阶段，大家分工合作，每个小组只配制一种酸度的缓冲溶液，实验时可以相互借用。在仪器操作阶段，由于时间宽裕和人数适当，大家都能有多次的操作机会，从而可以在实际过程中真正掌握仪器的操作，让大型仪器在教学过程中得到充分应用。

(3) 由于仪器分析实验使用的都是大型精密仪器，面对的都是高年级学生，所以不设绪论课；对于实验报告的书写也没有统一格式，既可以按传统方式完成，也可以通过查阅相关文献，最终结合实验内容提交电子版实验报告。

(4) 此次课程的开设还有望为接下来做毕业论文设计的学生及早做出定位，选择自己感兴趣的课题。比如学习了荧光分光光度计后，希望做发光材料改性研究方向的学生就可以利用课余时间查文献，到相关课题组实习，为毕业论文工作的开展提前打好基础。

参 考 文 献

[1] Licciardi M,Giammona G,Du J,etal.Polymer,2006,47:2946

[2] Andrew R H,Philip S L.JPharmSci,2005,94(10):2135

[3] Wittle E L,O′Dell B L,Vandenbelt J M,etal.JAmChemSoc,1947,69(7):1786

[4] 张国旺.水溶性CdTe纳米粒子的制备及其荧光性能.上海大学化学系硕士学位论文，2008