IHC和FISH联合检测164例乳腺癌中Her-2表达的临床意义

周庆云，赵 洁，田 芳，王东存，孙建平

(甘肃省妇幼保健院，兰州 730030)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，且发病率呈逐年上升的趋势。目前研究证实［1］:人表皮生长因子受体2(Her-2)在25%～30%的原发性浸润性乳腺癌中有基因扩增和蛋白的过度表达。对一般化疗方案无效，肿瘤易早期复发且患者生存期缩短，靶向治疗药物赫赛汀(Herceptin)自问世并成功用于临床，已使很多Her-2高表达的患者受益，这提示准确测定Her-2基因状态至关重要。目前临床检测Her-2方法有两种:一是检测Her-2蛋白的免疫组织化学法(immunohistochemical method，IHC)，另一种是检测Her-2基因的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)。两种方法各有优缺点，相辅相成，美国FDA承认用FISH技术检测出Her-2基因的扩增为能进行Herceptin治疗的金标准［2］。我们应用FISH和IHC联合检测乳腺癌患者Her-2基因及Her-2蛋白表达，分析二者之间的差异性和一致性，为乳腺癌患者个体化治疗方案的设计及其预后的评价提供可靠实验依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集我院2010年10月至2013年7月乳腺癌标本164例，患者均为女性，年龄23～82岁，平均47.5年龄，术前均未接受放疗、化疗。所有标本经4%甲醛固定，石蜡包埋。其中浸润性导管癌149例，浸润性小叶癌3例，髄样癌2例，黏液癌4例，小管癌3例，微乳头状癌2例，筛状癌1例。

1.2 方法 用FISH和IHC法分别检测实验标本中的Her-2基因扩增和Her-2蛋白表达。

1.2.1 荧光原位杂交技术 GLP Her-2/CSP17探针试剂盒(购自北京金菩嘉医疗科技有限公司)，切片厚度3μm，烤片2 h，室温下脱蜡，90℃水浴锅水化20 min，70%乙醇洗后晾干，蛋白酶K 37℃消化，2×SCC 3 min，4%甲醛固定10 min，2×SCC 3 min，梯度乙醇(75%，85%，100%)脱水各3 min，晾干后加探针2μl+8μl，杂交仪 83℃变性，40℃杂交过夜，46℃ ±1℃水浴锅内(2×SCC 7 min，2×SCC 10 min，0.1%NP-40/2 ×SCC 10 min)，70%乙醇提洗3 min，自然晾干后加DAPI复染液(4℃冰箱放置10 min)，盖玻片封片后荧光显微镜选择合适通道观察。

1.2.2 免疫组化技术 免疫组化单克隆抗体即用型非生物素免疫组化MaxVision TM快速法检测试剂盒(购自迈新生物技术开发有限公司)。切片厚度3μm，常规烤片、脱蜡入纯水。组织切片放入pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，高压抗原修复，用 PBS(pH7.4)充分洗涤后加入一抗4oC冰箱过夜，PBS充分洗片，切片滴加即用型MaxVision TM试剂，室温孵育15 min。洗涤后加DAB显色，苏木素衬染，脱水，透明，封片。

1.3 结果判断

1.3.1 FISH 在40×物镜下观察信号，选择细胞核孤立无重叠，大小一致、核膜完整，绿信号清晰区域，在100×物镜下，通过特异的单通道滤光片随机计数30个细胞内信号。统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。Ratio＜1.8为阴性结果，提示样本中无Her-2基因扩增;Ratio＞2.2为阳性结果，提示样本中Her-2基因扩增，若两种信号的比值＞20或众多信号连接呈簇时，可不用计算，即视为基因扩增;Ratio在1.8～2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH实验来判断最终结果。

1.3.2 IHC 参照美国临床肿瘤协会/美国病理学家学院Her-2检测指南评分系统［3］:浸润性肿瘤细胞无着色为阴性(-)，瘤细胞呈弱且不完整的胞膜着色或＜10% 瘤细胞呈较弱的胞膜染色为弱阳性(+)，≥10% 瘤细胞有较弱但完整的胞膜着色或≤30%瘤细胞呈强且完整的胞膜着色为阳性(++)，＞30%瘤细胞呈较强的完整的胞膜着色为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法 使用SPSS 15.0统计软件进行实验数据分析。FISH和IHC检测结果采用配对计数资料的χ2检验比较差异性，以P＜0.05为差异有统计学意义，采用Kappa检验分析两者的一致性。

2 结果

2.1 乳腺癌中Her-2基因扩增和蛋白表达(表1)164例浸润性乳腺癌中，FISH检测Her-2基因扩增53例，阳性率为31.70%;按乳腺癌Her-2检测指南，IHC检测(-)和(+)为阴性结果，(++)和(+++)为阳性结果，本组IHC检测Her-2蛋白阳性(++～+++)137例，阳性率为83.53%。Her-2蛋白检出率明显高于Her-2基因扩增，两者阳性率有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 IHC法与 FISH法检测Her-2表达的相关性(表1和表2) 本组IHC检测Her-2蛋白阴性(-/+)共27例中有26例无基因扩增，96例(++)中有21例基因扩增，41例(+++)中有30例基因扩增，3组中 IHC和 FISH符合率分别为96.29%、21.87%、73.17%。本组结果显示 IHC检测 27例Her-2蛋白阴性(-/+)的患者和41例(+++)病例与Her-2基因扩增一致性较好(K=0.653，P＜0.05)。IHC检测96例Her-2蛋白(++)病例中只有21例基因扩增，符合率为21.87%;41例(+++)中有30例基因扩增，符合率为73.17%。两种方法检测Her-2基因是否扩增(阴/阳性率比较)差异具有统计学意义(P＜0.05);以 IHC方法检测Her-2蛋白表达阳性率较高;两种检测方法的吻合度一般(Kappa=0.479，P＜0.05)。

表1 Her-2蛋白表达水平与Her-2基因扩增情况［n(%)］

表2 IHC(++)和(+++)与FISH检验结果比较［n(%)］

3 讨论

Her-2基因(又称Her-2/neu或Her-2基因)是人类原癌基因，定位于人染色体17q21。在乳腺癌的发病、发展、预后和选择使用Herceptin生物靶向治疗中有重要意义，Her-2基因过表达的乳腺癌患者其癌细胞侵袭性强，易发生淋巴结转移，对化疗耐受，对内分泌治疗效果也不理想，其预后也较差［4］。2002年美国FDA批准了分子靶向药物Herceptin在临床治疗中的应用，它对于乳腺癌中具有Her-2基因扩增的患者具有良好的治疗效果，可以大大提高其生存期，而对Her-2基因无扩增患者治疗则是无效的。且其费用昂贵，又存在心血管疾病的潜在风险［5］。因而无论是临床医生还是患者对于该药物的选择都非常慎重。因此，准确检测Her-2基因及其蛋白表达显得极为关键。

目前，临床诊断常用IHC检测Her-2蛋白和FISH检测Her-2基因两种方法。IHC由于操作简单，费用低廉，可重复性好，对标本要求不高，因此在临床上被广泛应用。但其定量性不强，从组织固定、抗原修复、染色切片、判读、不同批号抗体之间的差异等都影响检测结果，17号染色体的非整倍体还会使检测出现假阳性［6］。FISH方法因其高度敏感性和特异性及高度重复性和可靠性在Her-2基因检测中被当作金标准用于Her-2基因检测。但FISH结果也会受到一些因素的影响，如标本固定时间长，烤片温度过高，蛋白消化不当，变性温度差异等，都会造成荧光信号减弱或无信号。鉴于上述这些影响因素，对IHC和FISH检测Her-2状态一致性的研究具有重要的临床意义。

本研究中，27例IHC阴性的病例中，FISH呈阴性者占96.29%(26/27)，两者结果具有较高一致性。既往研究发现［7］IHC-/+的病理与FISH检测的符合率可达95%以上，与本研究结果一致。但在96例IHC(++)患者中，FISH呈阳性者只占21.87%(21/96)，提示与FISH检测结果的一致性较差，被认为不确定的结果，与文献报道［8］IHC(++)的乳腺癌FISH阳性10% ～25%的结果一致。本研究中IHC检测Her-2蛋白表达(+++)者中只有73.17%表现为 Her-2基因扩增，与既往研究［9-10］IHC(+++)的病例与FISH检测阳性的符合率达90%以上国内外文献报道有一定差距。而与国内王晓兰等［11］报道的68%的检测符合率相近，依据上述结果提示IHC与FISH两种方法的检测结果存在较大的差异。Her-2蛋白表达为(++/+++)的样本中，仍然有一部分表现为Her-2基因无扩增。

有研究表明，对于FISH检测阳性患者，IHC检测阴性患者，其Herceptin治疗后的生存是与FISH检测阳性、IHC检测阳性患者的生存期一致，而FISH法检测阴性、IHC检测阳性患者，治疗后的生存与FISH法检测阴性、IHC检测阴性患者的生存期一致。这说明IHC检测存在假阳性，目前研究认为主要与17号染色体非整倍体有关［12］。本组研究IHC(++)患者中，FISH呈阳性者只占21.87%，是否因与17号染色体非整倍体有关出现了假阳性，或是因实验流程，检测结果质控欠规范，造成IHC与FISH两种方法的检测结果存在较大的差异，还有待于进一步研究。

综上所述，采用IHC检测Her-2蛋白表达时，可作为临床治疗是否应用Herceptin的初筛。初筛结果中IHC(-/+)的病例Her-2基因几乎无扩增，而无需再做FISH检测。而Her-2蛋白表达为(++)时，有必要进一步进行Her-2基因扩增的检测，Her-2蛋白表达为(+++)时可建议进行Her-2基因扩增的检测，来确定临床治疗是否应用Herceptin，为患者分子靶向治疗和预后评估提供实验依据。

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