血管紧张素原基因T174M位点多态性和α－内收蛋白基因多态性与高血压脑梗死的相关性研究

李广强，李宏芬，袁建新，王颖杰

遗传因素在脑梗死发病中起重要作用。血管紧张素原作为肾素－血管紧张素系统（RAS）唯一的初始反应底物，在脑梗死的发生、发展中起着相当重要的作用。α－内收蛋白是细胞膜阳离子转运系统内收蛋白的一个亚单位，与膜蛋白（如离子通道及离子泵）相互作用，参与细胞信号转导及细胞膜离子转运，尤其与多种Na＋转运机制密切相关。本研究采用单核苷酸多态性分析探讨血管紧张素原基因T174M位点和α－内收蛋白基因的多态性与脑梗死的关系，为脑梗死易患者的筛检、识别、预防和诊断治疗提供一定的理论数据。

1 资料与方法

1．1 研究对象 选取2007年1月—2009年1月在开滦总医院神经内科住院的首次发病72h内的住院脑梗死患者396例（病例组），男性286例，女性110例，年龄52岁～78岁（64．69岁±11．58岁）。选取同期健康查体者且结果均正常的360例为对照组，男性242名，女性118名，年龄51岁～75岁（65．59岁±10．90岁）。两组资料性别、年龄匹配，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 诊断标准 脑梗死诊断依据1995年全国第四届脑血管病会议制定标准，原发性高血压诊断标准依据1999WHO／ISH高血压处理指南。除外：具有心脏瓣膜、房颤、肿瘤等明显栓子来源的脑栓塞性疾病；既往有脑梗死、脑出血病史；肝肾功能不全、血液系统疾病患者；一个月内有各种炎症病史者。

1．2．2 DNA提取 用一次性采血器采集空腹静脉血5mL（0．5mmol／L EDTA－K2抗凝），低渗法分离白细胞，Tris－HCl饱和酚、氯仿－异戊醇法提取DNA，用于检测基因型。

1．2．3 基因多态性的检测 血管紧张素原基因T174M多态性的检测：AGT基因T174M引物参照Frossard等［1］的设计，上游引 物：5’GATGCGCACAAGGTCCTG3’；下 游 引 物：5’CAGGGTGCTGTCCACACTG GCTCGC3’（上海生工）。PCR反应体系及条件：PCR反应混合液25μL，其中含DNA模板（0．5～1）μg，引物（2pmol／μL）各0．5μL，2×Taq PCR Master－Mix12．5μL，无菌双蒸水9．5μL，混匀后，应用PE－9700扩增仪（美国PE公司）进行PCR反应，预变性94℃4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果：AGT基因T174M PCR扩增产物为303bp的DNA片段。

AGT基因扩增产物10μL，加1．25μL内切酶 NcoⅠ（10U／μL），10×BufferB 2μL，6．75μL无菌蒸馏水，37 ℃水浴过夜后终止酶切反应。2．5%琼脂糖凝胶电泳分型。若酶切后电泳只得到303bp条带则为TT型，酶切后产生303bp、211bp和92bp条带为TM型，产生211bp和92bp两条带为MM型。

α－内收蛋白基因G460T多态性的检测：α－内收蛋白基因G460T引物参照Beeks等［2］的设计，上游引物：5’CTCCTTTGCTAGTGACGG－ TGATTC3’；下游引物：5’GACTTGGGACT GCTTCCATTCGGCC3’（上海生工）。PCR反应体系及条件：PCR反应混合液25μL，其中含DNA模板（0．5～1）μg，引物（2pmol／μL）各0．5μL，2×Taq PCR MasterMix12．5μL，无菌双蒸水9．5μL，混匀后，应用PE－9700扩增仪（美国PE公司）进行PCR反应，预变性94℃4min，94℃变性30s，60℃退火30s，40个循环。扩增产物用2．5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果：α－内收蛋白基因PCR扩增产物为147bp的DNA片段。

α－内收蛋白基因扩增产物10μL，加1．25μL内切酶Cfr13Ⅰ（10U／μL），2μL 10×BufferB，6．75μL无菌蒸馏水，37℃水浴过夜后终止酶切反应。2．5%琼脂糖凝胶电泳分型。若酶切后电泳只得到147bp条带则为GG型，酶切后产生147bp、122bp和25bp条带为GT型，产生122bp和25bp的为TT型。1．2．4 统计学处理 应用SPSS13．0分析。基因型、等位基因频率比较采用χ2检验，两组间计量资料比较采用t检验，多因素危险分析采用Logistic回归分析。

2 结 果

2．1 Hardy－Weiberg遗传平衡定律检测 对照组中血管紧张素原基因T174M位点TT、TM两种基因型频率分别为94．2%，5．8%；T、M 等位基因频率分别为97．1%，2．9%（χ2＝0．00035；P＞0．05）。同样，对照组中α－内收蛋白基因GG、GT、TT三种基因型频率分别为22．8%、51．7%、25．6%；G、T等位基因频率分别为48．6%、51．4%（χ2＝0．420；P＞0．05）。群体检验血管紧张素原基因频率和α－内收蛋白基因频率符合Hardy－Weiberg平衡定律。该结果提示被研究群体有良好的平衡性和代表性。

2．2 AGT基因T174M基因型与脑梗死的关系 病例组AGT基因174位 点 的TT基 因 型88．7% （3 5 1／3 9 6），TM基 因 型11．3% （45／396）。对照组 TT 基因型94．2%（339／360），TM 5．8% （21／360），两组基因型频率比较（χ2＝7．238，P＜0．05）；等位基因频率脑梗死患者 T：94．3%（747／792），M：5．7%（45／792），对照组 T：97．1%（699／720），M：2．9%（21／720），两组等位基因频率比较（χ2＝6．908，P＜0．05）。用 OR值做患病风险评估，携带AGT基因174TM基因型的患病风险是AGT基因174TT基因型的2．070倍；携带M等位基因者的患病风险是T等位基因的2．005倍。

2．3 按高血压分层 病例组中有高血压患者302例，TT基因型83．4%，TM基因型16．6%；非高血压患者94例中，TT基因型93．6%，TM基因型6．4%。高血压患者等位基因频率T：91．7%，M：8．3%，非高血压人群 T：96．8%，M：3．2%。携带TM基因型及M等位基因者的患病风险分别是TT基因型和T等位基因的2．910倍和2．738倍。

2．4 α－内收蛋白G460T基因多态性与脑梗死的关系 病例组α－内收蛋白G460T位点的GG基因型22．2%（88／396），GT基因型52．0%（206／396），TT 基因型25．8%（102／396）。对照组 GG基因型22．8%（82／360），GT基因型51．7%（186／360），TT基因型25．6%（92／360），两组基因型频率比较（χ2＝0．033，P＞0．05）。等位基因频病例组G：48．2%（382／792），T：51．8%（410／792）。对照组 G：48．6%（350／720），T：51．4%（370／720），两组等位基因频率比较（χ2＝0．022，P＞0．05）。

2．5 AGT基因T174M与α－内收蛋白G460T联合基因型与脑梗死关系 将AGT基因T174M位点与α－内收蛋白G460T位点多态进行联合基因型分析，比较不同基因型组合在病例组对照组间的差异性，TM＋GT、TM＋TT两种基因型组合在两组分布有统计学意义（χ2＝8．125，P＜0．05；χ2＝4．680，P＜0．05）。详见表1。

表1 AGT基因T174M与α－内收蛋白G460T联合基因型比较 例（%）

3 讨 论

脑梗死是一个包括环境、遗传在内的多致病因素的综合征，高血压、高血糖、肥胖、吸烟、血脂异常等均为脑梗死发病的危险因素［3－5］，除此之外，随着分子遗传学研究的深入，寻找其相关致病基因并揭示相应发病机制，已经成为近几年的研究重点。

AGT是RAS的唯一底物，AGT多态位点基因突变可能导致AGT的浓度升高，使血压升高，增加脑梗死的风险。目前国内外对AGT基因T174M多态性与脑梗死的关系的研究尚少［6］。本研究对T174M多态性检测结果表明，T174M多态基因型与等位基因在两组中的分布明显不同，携带TM基因型及M等位基因者的患病风险是TT基因型及T等位基因的2．070倍和2．005倍。经Logistic回归分析校正混杂危险因素后，TM基因型仍为脑梗死的危险因素。该结果与刘艳等［7］的研究结论一致，提示携有AGT基因T174M位点TM基因型的个体可能是脑梗死发生的高危人群。此外，病例组按是否为高血压患者分层后，携带AGT基因174TM基因型及M等位基因者患病风险是174TT基因型及T等位基因的2．9 1 0倍、2．7 3 8倍，与Hegele等［8］对741例Hutterites人调查得出AGT基因变异与高血压关联，收缩压改变与T 174M位点突变有显著关系的结论相一致。本结果再次证实高血压是脑梗死的危险因素，且不排除AGT基因T174M基因多态致脑梗死发病过程中与高血压因素有协同作用。

目前，大量研究除了集中在神经内分泌调节领域外，还有盐平衡领域［9－11］。α－内收蛋白基因可能是一种盐敏感基因，人群受不同生活环境和生活方式的影响，在不同的盐摄入水平上遗传因子的作用也有明显差别［12］。本研究结果显示，α－内收蛋白多态基因型及等位基因在两组间无统计学意义，提示G460T多态性可能与脑梗死的发病无关。

α－内收蛋白基因突变可影响Na＋－H＋交换、Na＋－K＋－Cl－协调转运，增加肾钠重吸收，同时血浆肾素活性降低，血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型和2型受体上调，组织或局部的肾素－血管紧张素系统通过自分泌和旁分泌产生血管紧张素Ⅱ与两种上调受体结合，导致血管平滑肌细胞增殖、肥大，引起血管壁变厚、顺应性降低。将AGT基因T174M位点多态与α－内收蛋白G460T位点多态进行联合基因型分析，TM＋GT、TM＋TT基因型组合在两组分布有统计学意义，其患病风险分别增加了3．253倍和3．791倍，提示两组合基因型可能是脑梗死的易感因素，AGT基因T174M位点多态与α－内收蛋白基因多态性之间可能存在基因间的协同作用。多位点突变可能对脑梗死致病有协同作用，远大于各单一效应算术和，从而成为危险因素。Nakamura等［13］、钟 发 德 等［14］对 α－adducing Gly 460Trp、AGT Met235Thr基因交互作用进行了研究，均发现两基因同时存在时患高血压的风险较大。因此，临床联合检测AGT基因T174M位点与α－内收蛋白G460T位点多态性的改变对高血压脑梗死更具临床意义。

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