血管紧张素转换酶基因多态性对早发冠心病血瘀证的影响1）

胡志希，胡思远，李 琳，李 杰，凌 智，侯 超

冠心病（coronary heart disease，CHD）属中医“胸痹”范畴，究其病因有血瘀、痰阻、寒凝、气滞之别，但其基本病机则是“心脉不通”，血瘀证是冠心病中最常见的证型之一［1－3］。如果CHD的发病年龄较轻（男性≤55岁，女性≤65岁）称为早发CHD［4］。研究早发CHD血瘀证与血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性的相关关系以及对血管内皮功能的影响，明确早发CHD血瘀证的分子遗传学特征，具有非常重要的意义。

1 资料与方法

1．1 诊断标准 符合1979年 WHO缺血性心脏病“心绞痛”、“心肌梗死”诊断标准，以患者临床症状、体征和病史结合心电图改变或冠脉造影（CAG）进行诊断。以男性≤55岁，女性≤65岁患有冠心病者为早发冠心病。

按照1995年《中华人民共和国中医药行业标准·中医病证诊断标准》的辨证分型标准［5］；1997年《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语·证候部分》［6］；2002年国家中医药管理局医政司胸痹急症中国中医药学会内科学会心病专业委员会《中医心病诊断疗效标准与用药规范》［7］。主症：胸闷心痛，痛如针刺；兼症：面色晦暗／口唇青紫／爪甲发青；舌象：舌质紫暗／舌有瘀斑；脉象：细涩／结代。主症1项＋次症2项＋舌脉1项，为心血瘀阻证。

1．2 纳入标准 发病时年龄男性≤55岁，女性≤65岁；湖南地区出生；汉族；彼此无血缘关系。

1．3 排除标准 严重高血压，糖尿病，恶性肿瘤，肝肾疾病、甲状腺病患者。下列各种心脏病：糖尿病性心肌病、甲状腺功能亢进性心脏病、高血压性心脏病、肺源性心脏病、贫血性心脏病、系统性硬皮病性心脏病、风湿性心脏病。

1．4 研究对象 早发冠心病组选择湖南中医药大学附一院、附二院的住院患者。早发CHD血瘀证组41例，男25例，女16例，年龄（57．21±4．15）岁；早发CHD非血瘀证组45例，男28例，女17例，年龄（58．58±4．09）岁。正常对照组38名，男21名，女17名，年龄（59．71±4．18）岁。经统计分析3组间性别、年龄比较无统计学意义（P＞0．05），具有可比性。

1．5 临床指标检测 采用南京建成生物工程研究所eNOS试剂盒（硝酸还原酶法）测定eNOS；采用北京普尔伟业生物科技有限公司血浆内皮素（ET）放射免疫药盒（放射免疫分析法）测定。

1．6 DNA提取 参照《分子克隆实验指南》［8］传统酚抽提法提取血样中的DNA。

1．7 DNA纯度及浓度的确定 用移液枪吸取DNA溶液5μL至1．5mL EP管，用去离子水稀释至80μL；用紫外分光光度计分别测量波长260nm及280nm时的OD值，确定DNA的纯度和浓度；根据测得的DNA浓度将其稀释成约80ng／μL。当OD1／OD2在1．7～2．0，表明提取的DNA符合要求。

1．8 聚合酶链反应引物扩增（PCR） ①引物设计参照Rigat［9］，引物1：5’－CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT－3’；引物2：5’－GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T－3’，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。②反应体系：2×Taq MasterMix1）25μL；引物1：1．5μL（37．5Pmol）；引物2：1．5μL（37．5Pmol）；模板：5μL；ddH2O：17μL；总体积：50μL；Taq酶：100 U／mL dNTPs 400Um MgCl24mol／L Reaction buffer。③反应参数：轻微摇匀，微量离心机离心后，加液状石蜡20μL，放置PCR仪上，94℃变性4min，然后80℃以微量加样器插入液状石蜡油面下加入Taq酶2U。每个循环为94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min 30s，共30个循环，72℃延伸10 min。循环完毕，取出PCR管，放置4℃待测。④PCR产物鉴定及分型：人类ACE基因包含26个外显子及25个内含子，在16内含子中存在或缺失287bP的DNA片断可导致插入（I）或缺失（D）的存在，DNA组也出现3种相应的ACE基因型，即ⅠⅠ、ID、DD［10］。若在190bP左右出现一条带为DD型，在490bP出现一条带为II型，同时具有190bP、490bP两条带为ID型。1．9 统计学处理 采用SPSS15．0统计软件包分析。基因型及等位基因频率采用频数计算法。计量资料以均数±标准差±s）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验。计数资料组间比较用χ2检验或Fisher精确概率检验。计算比值比（OR）及95%可信区间（95%CI），检验水平a＝0．05。

2 结 果

2．1 各组临床资料比较（见表1） 血瘀证组、非血瘀证组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL－C）与正常对照组相比有统计学意义（P＜0．05），血瘀证组存在明显的脂质代谢失常，这与以往的研究相符合。在发现的18例有冠心病家族史患者中，14例属血瘀证，通过χ2检验，血瘀证组和非血瘀证有统计学意义（P＜0．05），血瘀证具有明显的遗传倾向。各组间性别、年龄、体重指数（BMI）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、血糖（BS）、高密度脂蛋白（HDL－C）均相近似（P＞0．05）。冠心病家族史早发冠心病血瘀证14例，早发冠心病非血瘀证4例。

表1 3组间各项临床资料比较

2．2 ACE基因基因型及等位基因频率分布 3组ACE基因型分布符合 Hardy－Weinberg平衡（P＞0．05），表明样本来源于同一人群，具有一定代表性。其中在早发CHD血瘀证组：II基因型6例，ID基因型9例，DD基因型26例；早发CHD非血瘀证组：II基因型15例，ID基因型18例，DD基因型12例；正常对照组：II基因型23名，ID基因型11名，DD基因型4名。正常对照组、早发CHD血瘀证组、早发CHD非血瘀证组3组相比，ACE基因基因型及等位基因频率分布有统计学意义（P＜0．05）。血瘀证组DD基因型及D等位基因频率高于非血瘀证及正常对照组。而II基因型及I等位基因频率明显低于非血瘀证及正常对照组。非血瘀证组基因型分布与正常对照组相比有统计学意义（P＜0．05），但等位基因频率与正常对照组相比无统计学意义（P＞0．05）。正常对照组与冠心病组相比，在基因型分布和等位基因频率分布两方面均有统计学意义（P＜0．05）。详见表2。

表2 ACE基因I／D基因多态性基因型及等位基因频率分布 例（%）

2．3 不同ACE基因型携带者发生早发CHD血瘀证的OR值

血瘀证患者与各组相比，DD基因型OR值均大于3，且95%CI区间不含1，表明DD型基因与早发CHD血瘀证发生关系密切，早发CHD患者DD型基因携带者易发生血瘀证。详见表3。

2．4 三组ET、NO及ET／NO比较 早发CHD血瘀证组ET与早发CHD非血瘀证组、正常对照组有统计学意义（P＜0．05或P＜0．01），血瘀证明显高于对照组和非血瘀证。NO测值各组之间相比无统计学意义。ET／NO以血瘀证最高，血瘀证与正常对照组相比有统计学意义（P＜0．01）。详见表4。

表3 DD基因型携带者发生早发CHD血瘀证OR值

表4 三组NO、ET及ET／NO比较（±s）

表4 三组NO、ET及ET／NO比较（±s）

与正常对照组比较，1）P＜0．05；与正常对照组比较，2）P＜0．01；与非血瘀证组比较，3）P＜0．05

组别 n ET（pg／mL） NO（μmol／L） ET／NO早发CHD血瘀证组 41 71．15±17．182）3） 152．37±29．27 0．50±0．132）早发CHD非血瘀证组 45 66．34±12．341） 145．18±18．60 0．47±0．09正常对照组 38 54．49±8．06 155．29±25．24 0．38±0．08

2．5 3组不同ACE基因型的ET／NO比较 对124例受检者各基因型间ET／NO分析结果表明，DD基因型ET／NO与ID、II基因型间相比均有统计学意义（P＜0．01），以DD基因型最高。三组间ET／NO值均以DD最高，其中以血瘀证最高。早发CHD血瘀证与正常对照组相比有统计学意义（P＜0．01），与非血瘀证组相比无统计学意义（P＞0．05），血瘀证ID基因型患者的ET／NO值与非心血瘀证组和正常对照者相比有统计学意义（P＜0．05）。详见表5。

表5 3组不同ACE基因型的ET／NO比较（±s）

表5 3组不同ACE基因型的ET／NO比较（±s）

与CHD非心血瘀阻证组比较，1）P＜0．05；与正常对照组比较，2）P＜0．05，3）P＜0．01；与组内DD基因型比较，4）P＜0．01

组别 II n ET／NO ID n ET／NO DD n ET／NO早发CHD血瘀证组 6 0．53±0．234） 9 0．59±0．121）2）4） 26 0．68±0．153）早发CHD与非血瘀证组 15 0．51±0．274） 18 0．55±0．14 12 0．66±0．19正常对照组 23 0．50±0．18 11 0．50±0．25 4 0．59±0．13全体受检者 44 0．52±0．20 38 0．55±0．19 42 0．61±0．28

3 讨 论

3．1 ACE基因多态性与早发CHD的关系 人类的ACE基因属单拷贝基因，定位于染色体17q23上，长21Kb，由26个外显子和25个内含子组成。近年来发现人类ACE基因存在插入／缺失多态性，即以其第16内含子中一长为287bp的Alu片段的有无为标志，分为插入（I）和缺失（D）两种等位基因和DD型（纯合子）、II型（纯合子）和ID型（杂合子）三种基因型。本项研究表明，早发CHD患者DD基因型及D等位基因频率明显高于正常对照组，与文献报道一致［11－13］，且 DD基因型OR 值为14．73（χ2＝23．42，95%CI为4．37～49．68，P＜0．01），说明 DD基因型可能与早发冠心病发生相关。

3．2 ACE基因I／D多态性与血清ACE、ET／NO的关系 以血浆ET与NO比值作为内皮细胞功能指标对二者关系进行了探讨，结果表明ET／NO比值DD型比II型明显升高（P＜0．05）［14］。ACE DD基因型患者 ET／NO 比值升高，认为这是ACE引起冠脉痉挛的另一重要作用机制［15］。本项研究发现，早发CHD血瘀证组、早发CHD非血瘀证组与正常对照组相比，血中ET、ET／NO相比均有统计学意义（P＜0．05），早发CHD血瘀证患者血浆ET含量明显升高，NO血清含量无统计学意义。通过对各组不同基因型ET／NO综合分析表明，在整个观察对象中以DD型ET／NO最高，各组之间也均以DD型ET／NO比值最高。且血瘀组DD基因型NO／ET明显高于非血瘀组、正常对照组，进一步说明早发CHD血瘀证的发病可能与ACE基因多态性分布密切相关。

3．3 早发CHD血瘀证与ACE基因多态性分布的关系 ACE基因I／D多态性与冠脉病变严重程度相关，且DD及D等位基因的频率随冠脉病变程度的加重而升高［16］。本项研究结果显示正常对照组、早发CHD非血瘀证组、早发CHD血瘀证组中的D等位基因频率分别为19%、42%、61%，DD基因型比例分别为4%、12%、26%，呈逐渐增高趋势，三组相比DD型基因及D等位频率有统计学意义（P＜0．01）。血瘀证组DD型基因及D等位频率明显高于非血瘀证组（OR＝4．76，95%CI：1．90～11．92，P＜0．01）及正常对照组（OR＝14．73，95%CI：4．37～4 9．68，P＜0．01），与整个观察对象相比有统计学意义（OR＝3．38，95%CI：1．62～7．07，P＜0．01）。DD型等位基因可能为早发CHD血瘀证候选的标志基因，但尚需进一步扩大样本数进行验证。同时尚需进一步进行血瘀证家系遗传学研究加以证实。

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