氟苯尼考在大鼠肠内吸收特征试验

张建平，胡海英，张正全

（郑州大学药学院，河南 郑州450001）

氟苯尼考（Florfenicol）是20世纪80年代由先灵－葆雅公司研制的一种新型兽医专用氯霉素类广谱抗菌药，具有抗菌谱广、体内分布广泛，特别是无潜在的致再生障碍性贫血的不良反应等特点，对敏感菌所致的畜禽细菌性疾病治疗效果显著。2000年该药在我国批准为国家二类新兽药，但在目前的氟苯尼考使用中存在不同剂型，及同一剂型的不同生产厂家产品在疗效上存在巨大差异，因此有必要对氟苯尼考的溶解度行为、生物吸收行为进行研究，以期找到临床疗效差异的原因及为高效快速吸收的制剂提供参考。饱和溶解度是药物重要的物理化学参数之一，药物溶解度的大小及在吸收部位溶解的状态直接影响了药物的吸收。大鼠在肠内循环模型研究药物吸收的方法，能避免胃内容物和消化道固有生理活动对结果的影响，可较客观的反映药物在肠道内的实际吸收情况［1］。作者采用该模型考察了氟苯尼考的大鼠肠内的吸收情况，为该药设计适当的给药剂型提供一定参考。

1 材料

1．1 材料及仪器 氟苯尼考原料药（湖北龙翔药业有限公司，批号：101152）；0．9%生理盐水（自制）、酚红（分析纯）、甲醇（色谱纯）及其他试剂均为分析纯；Angilent－1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AKasil C18色谱柱（Ajela博纳艾杰尔科技有限公司）；UV－2102型紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；DV15cd分析天平（梅特勒－托利多仪器公司，上海）。

1．2 试验动物 清洁级健康大鼠，体重200g±10 g，购自河南省实验动物中心，合格证号：410118。

2 方法

2．1 溶液的配制 Krebs－Ringer（K－R）磷酸缓冲液［2］：配制 pH 值7．4的 Krebs－Ringer磷酸盐缓冲液；肠循环液：在K－R缓冲液中加入适量的酚红和氟苯尼考，使酚红浓度20μg／mL，氟苯尼考浓度分别为 50μg／mL、100μg／mL、200μg／mL，取 100 mL作为肠循环吸收液。

2．2 酚红测定方法的建立 酚红的最大吸收波长为558nm，用紫外可见分光光度计测定其浓度，图谱显示无其他杂质峰干扰，小肠对酚红基本无吸收，因此可以通过酚红的浓度校正循环液体积。

2．2．1 酚红标准曲线的绘制 用K－R缓冲液配制100μg／mL的酚红作为储备液，用K－R缓冲液稀释至不同浓度，得浓度分别为4．95、9．9、14．85、19．8、29．7μg／mL酚红标准溶液。分别吸取上述浓度标准液0．5mL，置试管中，加入0．2mol／L氢氧化钠溶液0．5mL，摇匀，微孔滤膜过滤，以0．2mol／L氢氧化钠溶液为空白，在558nm处测定其吸光度A。

2．2．2 回收率测定 分别配制4．95、14．85、29．7 mg／mL酚红标准液各3份，加入氟苯尼考原料药，使其浓度为200μg／mL，按“2．2．1”项下方法处理，测定吸光度A，计算3种浓度酚红的回收率。

2．3 氟苯尼考方法学建立 氟苯尼考最大吸收波长为224nm，其他成分在此波长处测定无干扰，用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱条件：Akasil－C18（4．6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇－水（40∶60v／v），流速1mL／min，进样量20μL，柱温25℃。理论塔板数按氟苯尼考峰计算应不低于6×103，在该色谱条件下氟苯尼考峰与杂质峰的分离度应符合要求（如图1）。

图1 氟苯尼考色谱图

2．3．1 标准曲线的绘制 氟苯尼考的标准曲线 精密称取氟苯尼考9．9mg，用甲醇溶解，配成100μg／mL储备液，分别吸取一定量的储备液用蒸馏水稀释至4．95、9．9、19．8、39．6、49．5μg／mL的氟苯尼考标准溶液，10 000r／min离心15min，取上清液按“2．2．2”项下条件进样检测。

2．3．2 精密度考察 取质量浓度分别为4．95、19．8、49．5μg／mL氟苯尼考标准溶液，加入酚红，使其浓度为20μg／mL，分别连续进样3次，连续进样3d，检测氟苯尼考的浓度，求得方法的日内、日间精密度。

2．4 氟苯尼考饱和溶解度的测定［3－4］分别精密量取蒸馏水、乙醇、丙酮各10mL，置25mL锥形瓶中，平行3份，分别于25℃逐渐加入氟苯尼考至溶液中出现不溶性粉末为止。25℃恒温振荡器中强力振荡（200r／min），48h后取出，取5mL，5 000r／min离心10min，精密量取上清液适量稀释，参照“2．2．2”项下色谱条件进样检测，得氟苯尼考的饱和溶解度；余下饱和溶解度样品继续强力振荡（200r／min），24h后取出，上述同法测定氟苯尼考的饱和溶解度，对比两次测定结果的一致性。

2．5 氟苯尼考在大鼠肠内吸收试验 取试验前禁食12h（自由饮水）的大鼠3只，乙醚麻醉后将其固定于固定台上，用取暖器保持37℃体温。沿腹部中线切开腹部（约3cm），在十二指肠上部和回肠下部各切一小口（尽可能避开血管），在十二指肠小口处插入直径约1cm的塑料管，用棉线扎紧。用蠕动泵将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗去肠管内容物。洗净后在回肠下部的小口处插入相同的塑料管，并用棉线扎紧。将肠管两端的塑料管与蠕动泵相连，形成回路，将肠内残留的生理盐水尽量流尽后通入循环液，开始肠循环。回流开始后10min，从循环液中取样2份样品，一份1．0mL，另一份0．5 mL，分别作为药物和酚红的零点时间样品。其后每隔10min取相同2份，每次取样后立即补充1．5 mL酚红溶液（20μg／mL），取样至120min后停止回流，取出回流段小肠，测量其面积。

将1mL循环液样品10 000r／min离心15min后取上层液进样检测，根据标准曲线计算各个时间点循环液中药物浓度。另一份0．5mL循环液样品加入5mL 0．2mol／L氢氧化钠溶液，混匀，10 000 r／min离心15min，取上层液在558nm波长处紫外检测，计算循环液中酚红浓度。通过酚红浓度校正循环液体积，计算药物的剩余量。

3 结果

3．1 酚红方法考察结果

3．1．1 酚红标准液在558nm处测定其吸光度A

以吸光度A对分红浓度C进行线性回归，得回归方程：A＝0．016 5C＋0．001 0（R2＝0．999 3），线性范围为4．95～29．7μg／mL。

3．1．2 由“2．2．2”项下方法测定酚红回收率 各个浓度的RSD均小于15%，说明酚红回收率良好，可以满足测定的要求。

3．2 氟苯尼考方法考察结果

3．2．1 由“2．3”项下色谱条件测定氟苯尼考标准溶液的峰面积。以峰面积Y对浓度C进行线性回归，得标准曲线，回归方程：Y＝44．159C＋23．375（R2＝0．999 6），线性范围为4．95～49．5μg／mL。

3．2．2 由“2．3”项下色谱条件测定氟苯尼考的精密度。氟苯尼考的日内、日间精密度分别为5．79%、5．44%，均小于15%，可以满足测定要求。

3．3 氟苯尼考溶解度 由“2．3”项下色谱条件测定氟苯尼考溶解度，氟苯尼考在蒸馏水、乙醇、丙酮中的饱和溶解度分别为1．224、26．88、78．91mg／mL，在水中的溶解度较低，有机溶剂中溶解度增加。

3．4 氟苯尼考在体肠循环结果 循环结束后测得小肠的面积，并根据剩余量（S）＝St－Wt；Wt＝Ct－1·Vt－1－Ct·Vt；Vt＝［（Vt－1－1．5）·Pt－1＋1．5P］／Pt。

吸收率R＝（初始药量－120min剩余药量）／初始药量×100%；

St－t时间药物的剩余量；Wt－t时间小肠吸收的药量；

Ct－t时间循环液中药物的浓度，可通过液相色谱法测得；Vt－t时间循环液体积；

Pt－t时间循环液中酚红的浓度，可通过紫外分光光度法测得。

计算结果见表1～3。

以剩余量（S）的对数对时间t作图得到1条直线（如图4），以直线斜率b求出吸收速率常数：ka＝－2．303×60b，根据t1／2＝－0．693／ka求出半衰期，根据吸收率公式求出吸收率，并且根据小肠面积计算出单位时间单位面积（h·100cm2）的吸收率，结果如表4所示。

表1 低浓度氟苯尼考大鼠肠循环

表2 中浓度氟苯尼考大鼠肠循环

表3 高浓度氟苯尼考大鼠肠循环

由表1～3得氟苯尼考在大鼠肠内吸收结果，见表4。

由表4可知，低、中、高浓度大鼠肠吸收的吸收速率常数分别为0．221h－1、0．221h－1、0．235h－1，半衰期分别为3．135 7h、3．135 7h、2．961 5h，2h吸收率分别为为35．75%、36%、35．56% ，循环液中药物浓度下降与循环时间呈线性，说明氟苯尼考的吸收为一级动力学吸收过程，以被动扩散为主。

图2 lg（剩余量）与时间t的关系图

表4 氟苯尼考肠吸收

4 讨论

在肠内循环模型广泛应用于药物处方前的研究工作，该模型保证了胃肠道神经及内分泌输入的完好无损，且血液及淋巴液供应不变，大鼠胃肠道的生理状况与人相似，因此该模型较好地模拟预测体内吸收情况。由于试验中肠道能吸收或排泄水分，循环液体积会发生改变，因此本试验采用酚红来标定循环液体积（酚红为大分子络合物，小肠对其基本无吸收）。

本试验通过对氟苯尼考在不同溶剂中的溶解度测定，可知氟苯尼考水溶性低于脂溶性，推测氟苯尼考溶解度低，生物渗透性差，原料药的生物利用度可能较低。试验中建立的大鼠在肠内循环模型对氟苯尼考的吸收作了考察，原料药吸收率较低，进一步证明氟苯尼考生物利用度低，该药可能是生物药剂学中的第三类药物，即溶解度低，生物渗透性低，可考虑将其制成速释或长效制剂，有文献报道将氟苯尼考制成固体分散体［5］、纳米粒乳［6］、微球［7］等新型给药系统，对该药物的溶解性能和吸收有一定贡献。本试验通过对氟苯尼考溶解度及在肠内吸收的考察，达到了一定的预期目标，为今后氟苯尼考进一步研究及深层次的推广做出了一定贡献。

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