1株鸿雁源新城疫强毒的分离鉴定

陈雪龙，吴海燕，王忠伟，郭 丽，齐艳萍，2

（1．黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆163319；

2．农业部农产品加工质量监督检验测试中心（大庆），黑龙江 大庆163319）

新城疫病毒（NDV）是一种严重危害养禽业的重要传染病病原，曾经对全球养禽业造成严重经济损失。过去一般认为水禽对NDV的易感性较差，多呈隐性感染［1］。然而自20世纪90年代以来，国内外愈来愈多的报道显示NDV对水禽的致病力逐渐增强，鹅、鸭等水禽已成为易感禽类［2］。

2012年5月，黑龙江大庆某大雁养殖场的大雁（后鉴定为鸿雁）中发生了以轻微呼吸道症状和稀便、腿麻痹、站立不稳等为主要症状的疾病，使用多种抗生素治疗无效。为了查明发病原因，采集了发病大雁病料，进行了病原分离鉴定工作。

1 材料与方法

1．1 主要试剂及试验动物 TRIzol试剂、M－MLV反转录酶、RNasin、dNTP，购自Invitrogen公司；ExTaqDNA 聚合酶、DNA Marker（DL－2 000），购自宝生物工程（大连）有限公司。NDV标准阳性血清、H5、H9亚型禽流感病毒（AIV）标准阳性血清、减蛋综合征病毒（EDSV）标准阳性血清，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；阴性血清，购自瑞普生物药业有限公司。PBS、1%鸡红细胞、双抗（浓度为4 000IU（μg）／mL的青霉素与链霉素）按常规方法本实验室自制。

实验用1日龄及6周龄SPF雏鸡和10日龄的SPF鸡胚，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1．2 病料处理 现场采集大庆某大雁养殖场发病鸿雁（Ansercygnoides）的脑、脾、肺、肠等组织。其后于实验室内将病料剪碎研磨，用灭菌PBS按照体积比1∶4制备悬液，反复冻融3次后，8 000r／min离心10min，取上清加入双抗，37℃作用1．5h，－20℃保存备用。

1．3 病毒分离与血清学鉴定 将病理处理后的上清液接种鸡胚，每胚接种200μL，共接种4个10日龄SPF鸡胚，每天照蛋3次，弃去24h内死亡的鸡胚，收获36～96h死亡鸡胚的尿囊液进行血液凝集试验（HA），若有血凝性再与NDV阳性血清、AIV阳性血清（H5／H9）和EDSV阳性血清进行血凝抑制（HI）试验，操作方法按文献［3］方法进行。

1．4 分离株F基因RT－PCR鉴定

1．4．1 引物设计 参照GenBank中发表的鸭NDVF基因序列设计一对通用引物，用于扩增F基因，序列如下：上游引物 P1：5′－GAGGTTACCTCYACYAAGCTRGAGA－3′，下游引物P2：5′－TCATTAACAAAYTGCTGCATCTTCCCWAC－3′，预计目的扩增片段为535bp。

1．4．2 RT－PCR反应 取尿囊液，按照 TRIzol试剂说明提取病毒RNA，加入适量的DEPC处理水溶解。在 PCR 管中加入 RNA 10．5μL，10μmol／L dNTP 2μL，20μmol／L 上游引物2μL，5×RT Buffer 4μL，40U／μL RNasin 0．5μL；200U／μL M－MLV 1μL，反应总体积20μL，混匀在42℃水浴中作用1．5h。PCR反应体系采用25μL体系，模板cDNA 3μL，10×Buffer 3μL，F1、F2 引物各1 μL，dNTP 3μL，Ex－TaqDNA聚合酶1μL，DEPC水13μL。PCR反应条件为95℃3min，94℃40s，54℃30s，72℃1min，进行30个循环后，72℃延伸10min，最后取PCR产物5μL，在10g／L琼脂糖凝胶上电泳观察结果。

1．5 NDV致病指数测定 参照文献［4］方法进行致死鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）和6周龄雏鸡静脉接种致病指数（IVPI）等NDV致病指数的测定。

1．5．1 MDT的测定 将尿囊液用灭菌PBS作10倍稀释成10－6～10－10，每个稀释度经尿囊腔接种6个10日龄SPF鸡胚，0．1mL／个，置37℃培养，弃去24h内死亡鸡胚，每日照蛋3～4次，连续观察7d，记录使所有鸡胚死亡的最高稀释度致死鸡胚的平均时间（MDT）。

1．5．2 ICPI的测定 用灭菌PBS（1∶10）稀释病毒尿囊液，接种10只1日龄的非免疫雏鸡，每只脑内接种0．05mL。每天在与接种相应的时间观察鸡群的健康状况，并对试验鸡进行评定：正常记0分，发病记1分，死亡记2分。连续观察8d，最后计算ICPI。

1．5．3 IVPI的测定 将分离株尿囊液以PBS稀释10倍，翅静脉接种6周龄SPF鸡10只，0．1 mL／只，每天在与接种相应的时间检查鸡群的健康状况，连续观察10d。记录正常、发病、麻痹与死亡鸡的每日累计数，最后计算IVPI。

2 结果

2．1 鸿雁临床症状及剖检变化 现场观察病雁表现一定程度的精神不振，食欲和饮水减少；鼻孔流出少量清亮水样液体，张口伸颈呼吸；腹泻，排白色、黄色或黄白色稀便；翅膀下垂，双腿轻微麻痹无力，站立不稳或者不愿行走。

经剖检观察：腹段食管黏膜有白色坏死点；肠黏膜严重坏死脱落并伴有较为严重的出血；脾脏色暗红并肿大，可见不规则的灰白色坏死点；肺脏表面有纤维素性渗出物形成纤维性假膜；肝脏边缘散在有针尖大出血点和黄白色坏死点，胆囊壁增厚并扩张；腺胃乳头有出血点，与肌胃交界处出血或有溃疡灶；心外膜和心内膜均有出血点，并有白色坏死灶；脑轻微水肿、充血；其他组织或器官无肉眼可见病变。

2．2 病毒的分离与初步鉴定结果 鸡胚接种后，大多数在接种后45～70h死亡，胚体有出血现象，尤其胚体的头、颈和爪出血严重。收集死亡鸡胚的尿囊液，HI试验测得死亡鸡胚的尿囊液均具有血凝价（6～9lb）。分离株的这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制，而不能被流感 H5、H9亚型AIV和EDSV阳性血清所抑制，说明分离毒为NDV，命名为DQBT01。

2．3 分离株F基因RT－PCR扩增鉴定结果 对病毒尿囊液进行F基因的RT－PCR扩增后，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，检测结果如图1所示：

图1 NDV F基因RT－PCR扩增结果

如图1所示，对照DNA相对分子质量标准，NDV特异性检测引物的扩增片段长度为535bp，扩增结果与预计片段大小相同，因此可以进一步判断此分离毒为NDV。

2．4 NDV的致病指数测定结果

2．4．1 MDT的测定结果 分离毒株尿囊液接种10日龄SPF鸡胚后的死亡情况见表1，从表中可见，引起全部鸡胚致死的最高稀释度为10－8，经计算，MDT为55h。

表1 DQBT01分离株MDT测定

2．4．2 ICPI测定结果 1日龄雏鸡脑内接种分离病毒发病及死亡情况见表2，雏鸡接种后2～4d后出现典型症状进而死亡。雏鸡剖检见腺胃黏膜充血，十二指肠充血、出血。经计算ICPI为1．68。

表2 DQBT01分离株ICPI测定

2．4．3 IVPI测定结果 6周龄SPF鸡静脉接种分离病毒发病及死亡情况见表3，接种后第2天雏鸡开始出现症状并有2只死亡，在接种第四天SPF鸡全部死亡，剖检主要在腺胃和肌胃交界处有出血斑或出血带，腺胃黏膜肿胀充血。按公式计算：IVPI为2．54。

表3 DQBT01分离株IVPI测定

3 讨论

本试验从发病死亡的鸿雁体内分离得到1株病毒，该病毒可使SPF鸡胚出现全身出血性变化，死亡鸡胚的尿囊液经过血清学试验以及NDVF基因RT－PCR扩增证明该病毒株为 NDV，命名为DQBT01。该病毒MDT、ICPI和IVPI致病指数分别为55h、1．68、2．54，按照 OLE标准属于 NDV强毒株。

NDV对鸟类感染宿主范围比较广，目前经过报道的野禽已达200多种［5－7］，一般情况下，野禽在自由生活状态下对NDV的有较强的抵抗力，因此所分离的NDV大部分为弱毒株。而在人工饲养条件下，多种野禽可以感染NDV并发病，其涉及的公共卫生问题也受到了高度关注。目前在我国越来越多的野禽感染NDV并且发病的报道越来越多［8］，涉及的物种也开始增多，大雁感染NDV并且发病的报道也有少量报道［9］，而前人认为水禽对于NDV可以携带而不发病，因此认为水禽对NDV有较强的抵抗力。然而，随着鹅、鸭、大雁等水禽感染NDV并且发病的报道逐渐增多，说明在我国NDV的致病性有增强的趋势［10］。同时NDV在野禽和家禽间存在相互感染并传播的现象，并且在相互传递的过程随着宿主免疫系统的选择压力不同，NDV存在着一定程度的变异，这种变异可能导致毒力变强，而这种变异趋势已引起研究者的高度关注，如有研究报道，野禽中自然存在的无毒力毒株，但当其在鸡群中传播时，则具有变成高致病性病毒的能力［11］，这对于我国的养禽业是严重的威胁。

本次从鸿雁体内分离出NDV强毒株，为野生水禽在人工饲养条件下感染NDV并发病提供了相关依据，提示禽类养殖业，特别是水禽养殖业，对于NDV的防疫要引起足够的重视，这对于我国控制ND的传播和流行，降低养殖户的损失具有重要意义。

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