鸭链球菌的分离鉴定及其16SrRNA基因序列分析

卢受昇，孔令辰，罗晶璐，张 翰，孙彦伟

（广东省动物卫生监督总所，广东 广州510230）

鸭链球菌病是由链球菌引起的鸭的急性或慢性传染病，雏鸭感染主要表现为急性死亡，一旦发病，可引起大量死亡。成年鸭和种鸭感染主要表现为跛行与瘫痪，死亡率一般较低，对生产性能产生较大的不良影响，造成经济损失［1］。2011年6月，某鸭场先后引进雏鸭两批，其中第1批4 000羽于7日龄发病，4d后，第2批4 000羽（3日龄）也开始发病，表现为拉稀，缩头，精神差，脚软，减食，其后出现死亡，立即使用氟苯尼考、硫酸新霉素等药物进行治疗，病情得到有效控制，全程两批鸭共死亡100多只。现将诊断情况介绍如下，供读者参考。

1 材料与方法

1．1 材料 病料：某肉鸭场10日龄病死雏鸭。

试验动物：1日龄健康雏鸭，饲养观察到5日龄。

主要仪器与试剂：营养琼脂、血液琼脂、麦康凯琼脂培养基为广州环凯微生物科技有限公司产品，在使用时自行配制；全自动微生物鉴定系统VITEK－32、GPI细菌生化鉴定卡、革兰染色液、接触酶试剂、氧化酶试剂均为法国梅里埃公司产品；药敏试纸为杭州天和微生物试剂有限公司产品；PCR预混试剂Premix Ex、载体pMD18－T、DH5α感受态细胞均为宝生物工程（大连）有限公司产品；DNA回收试剂盒 Wizard SV Gel and PCR Clean－Up System为Promega公司产品。

1．2 方法

1．2．1 剖检与细菌分离 常规方法对病死鸭进行剖检。无菌操作采集肝脏、心血，接种于营养琼脂、血液琼脂、麦康凯琼脂平板培养基，37℃培养24h。1．2．2 生化试验 将细菌的纯培养物，按试剂说明书进行氧化酶、触酶试验，再选用梅里埃细菌生化鉴定卡GPI在VITEK－32全自动微生物鉴定系统中进行鉴定。

1．2．3 药敏试验 纸片法，按试剂说明书进行。

1．2．4 动物试验 用灭菌生理盐水，将培养基中的菌落洗下（约2个麦氏比浊度），腿肌注射，接种5日龄雏鸭8只，每只0．5mL，对照组雏鸭8只，以同样的方式和剂量接种生理盐水。每天进行观察，对死亡鸭只进行剖检，并从肝脏和心血中分离细菌。

1．2．5 16SrRNA序列的测定 引物采用细菌16S rRNA 通用引物 F27：5′－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3′，R1492：5′－TACGGYTACCTTGTTACGAC－TT－3′，扩增长度约为1 500bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增采用50μL体系，Premix EX 25μL、上下游引物各1μL、去离子水20μL、菌液3μL；反应程序为95℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环；72℃ 延伸8 min。产物电泳回收后，与载体pMD18－T连接，转化到DH5α中，经克隆鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

2 结果

2．1 病理剖检 剖检病变主要为：全身充血、出血；肝脏肿大、充血出血；脾脏肿大，有灰白色坏死点；肾轻度出血，输尿管有白色尿酸盐沉积；跗关节稍肿大，关节液增多；脑膜下出血（见中插彩版图1）。

2．2 细菌培养及染色特性 从肝脏、心血中分离到一种菌落形态较一致的细菌。营养琼脂上菌落为灰白色细小菌落，生长很贫瘠；血液琼脂上菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑、扁平隆起、淡白色的细小菌落，呈α溶血；麦康凯琼脂上不生长（见中插彩版图2）。取纯培养物进行革兰染色，结果为革兰阳性球菌，呈单个、成对、短链状或成堆排列（见图3）。

图3 革兰染色结果

2．3 生化鉴定结果 氧化酶试验为阴性，触酶试验为阳性。全自动微生物鉴定系统VITEK－32的GPI卡的鉴定结果为Streptococcus anginosus（Strep．milleri）（咽峡炎链球菌）或Streptococcus asnguinis（Streptococcus sanguis）／gordonii（血链球菌），鉴定值分别为77%和15%。具体生化特性见表1。

表1 GPI卡VITEK－32全自动微生物鉴定系统生化鉴定结果

2．4 药敏试验结果 纸片法药敏试验结果为先锋必、先锋Ⅴ、先锋噻肟、青霉素G、氨苄青霉素、氧呱嗪青霉素、苯唑青霉素、菌必治高度敏感；复达欣、头孢拉定、氧氟沙星、万古霉素、氯霉素敏感；环丙沙星、阿米卡星、氟哌酸、强力霉素低敏；红霉素、卡那霉素、利福平、呋喃妥因、痢特灵、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、四环素、复方新诺明完全耐药。

2．5 动物试验结果 接种后表现为精神沉郁，拉稀，厌食，脚软，接种后第2天死亡3只，第4天死亡2只。随后，剩余的3只，精神、食欲逐渐转好，到接种后11d，基本痊愈。对照组鸭只正常。从每只病死鸭的肝脏和心血中，均分离到菌落形态一致的细菌，经鉴定，形态与生化特性与接种菌相同，成功的进行了人工发病试验，进一步证实了本病例的病原为该链球菌。

2．6 扩增结果 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，可见1 500bp左右的特异条带（图4），与预期大小相符。

2．7 序列分析 测序结果已提交GenBank（收录号为JN594664），将所得菌株的16SrRNA基因序列在NCBI上用BLAST进行同源性比较，结果与Streptococcus pasteurianus（巴氏链球菌，序列号AP012054）相似性达100%。在最靠前25个序列中，有16个为巴氏链球菌，有6个为Streptococcus gallolyticus（解没食子酸链球菌），另3个为未能鉴

图4 PCR扩增结果

定的细菌，与该菌株的相似性在98%～100%。从GenBank数据库中选取不同种的链球菌参考株14株，沙门菌、鸭疫里默氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、多杀性巴氏杆菌各1株（见表2），将其16S rRNA基因序列，用软件 MEGA 5．05进行多序列匹配排列，以Neighbor－Joining方式进行同源性比较，并绘制进化树。结果发现，各种链球菌16S rRNA基因序列间存在一定的差异，但差异不超过4%，本菌与巴氏链球菌参考株关系最近；其次为解没食子酸链球菌、牛链球菌，相似性均超过了99%；与咽峡炎链球菌相似性为98．46%；与变形链球菌的距离最远，差距达3．17%。本菌与大肠杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌的同源性差异约为14%；与鸭疫里默氏菌的同源性则更远，超过16%（图5）。

表2 参考16SrRNA基因序列来源及数据库存取号

图5 16SrDNA序列分析结果

3 讨论

3．1 本分离株生化鉴定结果为咽峡炎链球菌，鉴定值较为77%，通过进一步测定其16SrRNA基因序列，其与巴氏链球菌最为接近，两种鉴定结果存在差异，但由于生化鉴定值较低，仅为77%，且其16S rRNA基因序列与咽峡炎链球菌的相似性为98．46%，低于“同一个种同源性为98．8%的标准”［2］，故将本分离株定为巴氏链球菌。

3．2 将分离株接种健康雏鸭，成功复制出与原来相同的症状及病变，发病率达100%，致死率达62．5%，说明本病例由巴氏链球菌引起，且本巴氏链球菌分离株具有较强的毒力。鸭链球菌病多感染雏鸭，多呈急性败血性感染，鸟链球菌、兽疫链球菌、粪链球菌等感染雏鸭，兽疫链球菌感染成鸭的链球菌病已有报道［3］，但由巴氏链球菌引起的未见报道，在当前养鸭业不断朝着集约化方向发展，养殖密度不断增大，水质日益恶化的条件下，该菌的致病作用增强，是否会成为危害养鸭业的一种新病需引起关注。

3．3 本病可通过用药进行治疗和预防。对该菌株的药敏试验结果显示，青霉素类药物高敏，氯霉素类药物敏感，本病例中及时应用氟苯尼考进行治疗，成功的地控制了病情，将死亡率降至2%以下，及时用药物进行治疗是减少损失的关键。

3．4 对于本病的预防，除了在发病敏感期前使用药物外，更重要的是采取降低饲养密度，优化水质，改善饲养条件，加强环境消毒等综合防控措施。

3．5 通过16SrRNA基因的序列测定，从分子遗传进化和分子水平对细菌进行鉴定，使细菌鉴定更加科学与准确［4］。当前，对链球菌属的各种细菌进行鉴定，存在一定的难度，但以16SrRNA基因序列相为基础，加上酶切分析及各种的特征性序列分析，能很好的将链球菌鉴定到种［5］，16SrRNA序列测定可作为细菌鉴定的一种可靠方法。

［1］ Y．M．Saif．禽病学（第十一版）［M］．苏敬良，高福，索勋译．北京：中国农业出版社，2005：917－921．

［2］ 韩文瑜，冯书章．现代分子病原细菌学［M］．长春：吉林科学技术出版社，2003：160．

［3］ 李峰，苗立中，沈志强，等．鸭链球菌病的诊断与防治［J］．水禽世界，2009，2：39－40．

［4］ Lee－Jene Teng，Po－Ren Hsueh，Yu－Hsuan Huang，etal．I－dentification of bacteroides thetaiotaomicron on the basis of an unexpected specific amplicon of universal 16Sribosomal DNA PCR［J］．Journal of Clinical Microbiology，2004，42（4）：1727－1730．

［5］ Margot E，Grinwis Christopher D，Sibley Michael D，Parkins，etal．Characterization of streptococcus milleri group isolates from expectorated sputum of adult patients with cystic fibrosis［J］．Journal of Clinical Microbiology，2010，48（2）：395－401．