鸭基因组整体DNA甲基化差异与部分免疫性状的关系

徐 琪，陈 阳，黄正洋，张 扬，李欣玉，甑 霆，李 秀，段修军，陈国宏

（1．江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏 扬州225009；2．江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌330045；3．国家水禽种质资源基因库，江苏 泰州225300）

DNA甲基化是真核细胞基因组主要表观遗传修饰方式之一，是调节基因组功能的重要手段，在基因表达调控、细胞分化、肿瘤发生、染色质变构、转座子失活、基因沉默等生物过程中起着重要作用［1］。近年来，DNA甲基化研究取得了突飞猛进的进展，目前已深入到生物、医学、农业以及环境等各个领域。但越来越多的研究表明，人们更为关注的是某一个或某几个特定基因DNA甲基化研究［2－4］，而从全基因组的研究较少，在畜禽仅见猪、鸡上见有报道［5－6］。

DNA甲基化不仅影响到基因的表达，还会影响到性状的表达［7－8］。目前已知，DNA甲基化与疾病的发生密切相关，甲基化状态的改变是致病作用的一个关键因素，它包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高，这将导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、易感基因的表达）。本试验以金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、半番鸭（番鸭♂×金定鸭♀、番鸭♂×樱桃谷北京鸭♀）为试验材料，应用Methyl－Flash整体甲基化定量试剂盒检测金定鸭、樱桃谷北京鸭与番鸭及其杂交后代基因组甲基化程度的差异，并分析基因组整体甲基化水平与免疫性状的关系，以期探明半番鸭及其亲本基因组整体DNA甲基化对部分免疫性状的影响。

1 材料与方法

1．1 试验材料 试验鸭均由国家水禽种质资源基因库（江苏泰州）提供，随机选择同批出雏，健康的金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、金番鸭（番鸭♂×金定鸭♀）、樱番鸭（番鸭♂×樱桃谷北京鸭♀），各20只，饲养管理条件相同，按正常免疫程序免疫。10周龄时，采集EDTA抗凝血5mL，其中3mL用于淋巴细胞分离，2mL用于血清分离。

1．2 免疫指标的测定 分离后血清，按照全自动生化分析仪（日立7170A型）及试剂盒使用说明书（上海北加生化试剂有限公司）进行免疫指标的测定，总蛋白、球蛋白采用终点法，IgA、IgM、IgG采用免疫透射比浊法。

1．3 外周血淋巴细胞的分离与DNA提取 利用淋巴细胞分离液（上海生工生物工程技术服务有限公司），采用密度梯度离心法（Ficoll）分离外周血单核细胞（PBMCs），采用细胞基因组DNA快速抽提试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）提取分离细胞的DNA。

1．4 DNA整体甲基化水平检测 采用 Methyl－Flash整体甲基化定量试剂盒（Epigentek公司，美国）检测，操作步骤按试剂盒说明书进行，酶标仪上450nm处读取吸光度值，计算DNA甲基化水平。

1．5 数据处理 采用SPSS11．5软件进行统计分析，组间显著性检验采用麦角新碱（LSD）法多重比较，相关分析采用Pearson相关分析。

2 结果

2．1 DNA整体甲基化水平检测结果 5个鸭群体DNA整体甲基化水平检测结果见表1。两个远缘杂交种（番鸭♂×金定鸭♀、番鸭♂×樱桃谷北京鸭♀）的DNA整体甲基化程度显著高于或极显著高于亲本（金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭），而3个亲本间以及两个远缘杂交种间差异不显著（P＞0．05）。

表1 5个鸭群体DNA整体甲基化水平

2．2 鸭免疫性状测定结果 对金定鸭、樱桃谷北京鸭、番鸭、金番鸭和樱番鸭的总蛋白、球蛋白、IgA、IgM和IgG部分免疫性状进行测定，结果见表2。

表2 5个鸭群体部分免疫性状的测定结果 ±SD）

表2 5个鸭群体部分免疫性状的测定结果 ±SD）

群体 n 总蛋白（g／L） 球蛋白（g／L） IgA（g／L） IgM（g／L） IgG（g／L）金定鸭 20 49．05±3．00a 29．17±2．28a 0．17±0．05ab 0．24±0．10ac 0．30±0．09a樱桃谷北京鸭 20 47．38±8．97ac 29．10±6．44a 0．20±0．07a 0．25±0．13a 0．16±0．06b番鸭 20 45．42±2．83bc 26．44±2．06b 0．15±0．10b 0．21±0．10aef 0．12±0．06c番鸭♂×金定鸭♀ 20 42．60±4．83bd 23．98±3．18c 0．14±0．03b 0．16±0．05be 0．07±0．02d番鸭♂×樱桃谷北京鸭♀ 20 39．98±3．71d 22．67±2．37c 0．14±0．03b 0．17±0．07bcf 0．07±0．02cde

由表2可以看出，所有免疫指标大致表现为家鸭高于番鸭，番鸭高于半番鸭；除IgG外，金定鸭与樱桃谷北京鸭其他4项免疫指标间差异不显著（P＞0．05）；两种半番鸭间5项免疫指标间差异不显著（P＞0．05），且绝大多数性状均显著低于金定鸭和樱桃谷北京鸭（P＜0．05）。

2．3 鸭基因组整体DNA甲基化水平与部分免疫性状的关系 鸭基因组整体DNA甲基化程度与部分免疫性状相关性统计结果见表3和图1～5。

由表3和图1～5可以看出，鸭基因组整体DNA甲基化水平与免疫性状间呈负相关，其中与总蛋白、球蛋白和IgM相关达显著或极显著水平。

表3 鸭DNA整体甲基化水平与部分免疫性状的关系

图1 鸭DNA整体甲基化水平与总蛋白关系

图2 鸭DNA整体甲基化水平与球蛋白关系

图3 鸭DNA整体甲基化水平与IgA关系

图4 鸭DNA整体甲基化水平与IgM关系

图5 鸭DNA整体甲基化水平与IgG关系

3 讨论

本试验采用比色法，利用MethylFlash甲基化DNA定量试剂盒检测了鸭全基因组的5－mC，该方法能高度特异的识别5－mC，而不会与未甲基化的胞嘧啶结合，与基于套色板的方法相比（比如高效液相色谱仪（HPLC）或者质谱）相比，结果更精确可靠，也更稳定。本试验发现半番鸭及其亲本的基因组甲基化从1．2%到2．1%不等。一般认为在脊椎动物基因组中有3%的C是甲基化的，也有人认为在脊椎动物基因组内相邻的二核苷酸CpG的含量为20%，而CpG中70%的C是甲基化的，即1．4%的C是甲基化［9］，这与本试验结果是一致的。当然，基因组甲基化程度还与所检测的组织与细胞有关系，梁秋菊等人［10］研究发现，在猪肌肉基因组甲基化要显著高于血液DNA甲基化含量，本试验主要对外周血淋巴细胞基因组甲基化进行了检测，而淋巴细胞包含有T细胞、B细胞和NK细胞等多种细胞［11］，这可能多少对试验结果产生一定的影响。本试验发现半番鸭的甲基化含量高于亲本，而免疫性状表型值却低于亲本，这表明在杂种形成过程中某些位点发生了甲基化作用，或者说杂种利用甲基化关闭了一些抗性基因的有效表达。试验研究证实，杂种将两个不同的基因群组合在一起形成的不同于亲本的新的遗传体系，新的遗传体系不仅仅是所得遗传物质的简单组合，而是经历了复杂的调整过程，产生了一种不同于亲本的遗传与表观遗传信息。在新的体系中，亲本的基因型彼此协调、相互促进、有效地控制基因的表达，杂种在新的遗传体系中产生了不同于亲本品种的性状表现，这也就是半番鸭免疫性状表型值普遍低于亲本主要原因。本试验还发现鸭基因组整体DNA甲基化水平与免疫性状间呈负相关，这主要是由于DNA甲基化程度越高，基因表达受到抑制，其表型值也相应较低。

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［11］杨汉春．动物免疫学［M］．2版，北京：中国农业大学出版社，2003．