鸡肉空肠弯曲杆菌的污染率与耐药性分析

陈栎娜，陆思琴，陈 荀，刘书亮

（四川农业大学食品学院，四川 雅安625014）

空肠弯曲杆菌是一种主要的食源性病原菌，是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因［1］，可引起人的急性肠炎和食物中毒，并伴有反应性关节炎、格林－巴利综合征等免疫性疾病［2］。近年来，畜禽养殖业快速发展，大量抗生素被应用到生产中，导致该菌的耐药性显著增加。关于空肠弯曲杆菌耐药性的研究，主要在养殖场畜禽源，对于食源性菌株耐药性的研究较少。本试验对四川省雅安市市售鸡肉进行了调查，研究了其中空肠弯曲杆菌的污染率及耐药性。

1 材料与方法

1．1 样品 从雅安市定点屠宰场分4次共采集鸡胸肉、鸡翅、鸡肝样品共183份。

1．2 质控菌株 空肠弯曲杆菌（C．jejuni）ATCC－33560。

1．3 药品试剂 （1）培养基试剂：标准新生级牛血清，脱纤维羊血。（2）培养基：改良Skirrow氏琼脂基础，CCDA琼脂基础，布氏肉汤，哥伦比亚血琼脂基础，M－H 培养基；Cary－Blair运送培养基，Skirrow琼脂，哥伦比亚琼脂。（3）抗生素：红霉素（Erythromycin，EM），克林霉素（Clindamycin，CLI），环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），左氟沙星（Levofloxacin，LEV），链霉素（Streptomycin，STR），庆大霉素（Gentamicin，GEN），四环素（Tetracycline，TET），氟苯尼考（Florfenicol，FLO）。

1．4 主要仪器 CO2培养箱；微量移液器；显微镜；显微成像系统；超纯水系统。

1．5 样品的采集及运送 按 GB／T 4789．9－2003要求对鸡肉、鸡肝样品进行采样。

1．6 菌株的分离纯化 按张晓利［3］等创建的组合生化法进行增菌培养及分离纯化。

1．7 菌种鉴定

1．7．1 初步鉴定 根据菌落生长特征、革兰染色特征、氧化酶试验和过氧化氢酶试验结果，按GB／T 4789．9－2003进行。

1．7．2 二重PCR鉴定 （1）引物设计：针对弯曲菌属16SrRNA基因的引物（16S－F和16S－R，序列为5′－gcgaagaacctaccyggrcttgata－3′ 和 5′－tcgcgrtattgcgtctcattgtatatg－3′，产物大小314bp）和空肠弯曲菌hipO 基因的引物（HIP－F 和 HIP－R，序列 5′－gatctgcaaaattagtggcg－3′为 5′－gcaaaggcaaagcatccat－3′，产物大小149bp），进行设计。（2）PCR模板制备：挑取哥伦比亚血琼脂培养基上的菌落于布氏肉汤中培养48h，用热裂解法提取空肠弯曲杆菌DNA，将模板DNA置于－20℃备用。（3）PCR扩增：PCR 反应体系：10× PCR Buffer 2．5μL、25 mmol／L MgCl21．5μL、dNTP mixture 2μL、模板1 μL、10μmol／L引物各0．5μL、Taq聚合酶0．5μL，补水至25μL。循环参数：（95℃，5min）＋［（95℃，35s）＋ （56．5℃，40s）＋ （72℃，45s）］×35＋（72℃，7min）。（4）PCR 产物的鉴定及分析：用0．5×TBE电泳缓冲液配制1．0%琼脂糖凝胶溶液，100V电泳40min，于凝胶成像系统中拍摄分析电泳结果。（5）PCR鉴定为空肠弯曲杆菌的菌种进行冻干保存，备用。

1．8 药敏试验

1．8．1 配制 按CLSI规定进行药液配制［4］，将药物溶解，制成浓度为5 120μg／mL或2 560μg／mL的储藏液，于－20℃冰箱保存。使用前稀释到所需浓度。

1．8．2 试验 （1）药敏盒的制备：在无菌96孔板的各孔加入含10%新生牛血清的 M－H肉汤液100 μL，第一孔加入100μL药物，梯度稀释至最后一列，最后一孔吸取100μL混合液弃去。（2）接种和观察结果：将M－H肉汤培养48h的菌液稀释至0．5麦氏比浊管，用M－H肉汤稀释100倍。取100μL接种于药敏试剂盒，37℃微好氧条件下培养42h。加入0．5%TTC试剂1～2滴，培养30min，观察结果，以空肠弯曲杆菌标菌为质控菌株，符合最低抑菌浓度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）标准则判定菌株耐药［5］。

2 结果与分析

2．1 初步鉴定 从183份鸡肉中初步分离得到36株疑似菌株。在哥伦比亚血培养基上的菌落特征为不溶血、扁平、灰色不反光、半透明、白色、棕黄色凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的典型菌落，在CCDA培养基上为灰白、湿润的菌落。经涂片作革兰染色镜检为革兰阴性菌，如小逗点状，两菌体的末端相连时，呈S形、海鸥形或螺旋状。其过氧化氢酶试验均呈阳性、氧化酶试验均呈阳性，可初步判定为C．jejuni。

2．2 二重PCR鉴定 电泳结果表明（图1），从C．jejuni标准株中扩增出两个长约314bp和149bp的特异片段。根据所选择的两对特异性PCR引物对分离的36株疑似菌株进行二重PCR检测，其中25株C．jejuni能同时扩增出两条目的条带，其余菌株扩增出一条。综上可知，本试验从183份鸡肉样品中分离得到25株C．jejuni，污染率为13．66%。

2．3 药敏试验 肉汤微量稀释法测定分离菌株对常见抗菌药物的敏感性如表3所示，所有菌株对CIP、LEV耐受，对CLI、TET耐药率较高，所有菌株对FLO，GEN敏感（表2）。88%的菌株显示出多重耐药性（表3）。

图1 鸡肉中空肠弯曲杆菌PCR扩增产物的电泳图

表2 鸡肉中空肠弯曲杆菌分离株（25株）对8种药物的耐药率 （%）

表3 鸡肉空肠弯曲杆菌耐药谱

3 讨论与结论

本试验采用常规分离与二重PCR鉴定结合，从183份鸡肉样品中鉴定出C．jejuni25株，高于其他报道［3、6］，结果表明，调查的鸡肉C．jejuni污染较严重，对消费者有潜在威胁。

兽药在养殖业被广泛使用，导致C．jejuni的耐药性显著增加，使该菌的耐药性问题日益突出。试验结果显示，分离菌株对CIP、LEV耐药率达100%，对CLI、TET和EM 的耐药菌株分别为96%、84%和4%，对FLO、GEN敏感。国内外研究表明C．jejuni对EM，CLI，CIP有不同程度耐药性［7－8］，对 GEN 敏感。还有研究表明C．jejuni对CIP，TET 耐 药 率 分别为 71．4%［9］，13．7%［8］，有30．6%的菌株显示多重耐药性［10］。试验结果与以上研究比较，C．jejuni对CIP、LEV耐受性普遍较高，对CLI、TET的耐受率较之前研究报道明显升高。虽然本试验发现耐EM菌株较少，但仍需加强监控。试验表明C．jejuni对FLO、GEN的敏感性与国外研究报道一致。多重耐药性会阻碍C．jejuni病的防治，特别是在禽畜养殖行业中。本试验中88%分离菌株显示出多重耐药性，需在相关行业严格规范，遵守休药期规定，控制耐药性的产生和扩散，以预防疾病的发生。建立C．jejuni的污染现状和耐药性的资料文库，为国家对C．jejuni病的预警、预防和治疗具有重要意义。

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［2］ Ang C W，van Doorn P A，Endtz H P，etal．A case of Guillain－Bajrre syndrome following a family outbreak ofCampylobacterjejunienteritis［J］．J Neuroimmunol，2000（11）：29－32．

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