羔·羊·肺·炎·病·原·分·离·鉴·定

何卫新，康立超，杨 华，田 亮，黄 新，韩猛立

（1．新疆农垦科学院畜牧兽医研究所 兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆 石河子832000；2．新疆生产建设兵团农十二师一〇四团牧三场，新疆 乌鲁木齐830009）

2011年本场羔羊突然发病，发病率在5%左右，死亡率可达20%。因为该场原先暴发过牦牛多杀性巴氏杆菌病［1－2］，导致大批牦牛发病死亡。怀疑此次羔羊发病可能也与该菌有关，比较严重。随即，将濒死羔羊送往新疆农垦科学院畜牧兽医研究所诊断鉴定，剖检肺脏出现肉变和肝变，有化脓结节，其他脏器无明显变化。通过药敏试验指导用药，有效控制病情。进一步分析报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 濒死哈萨克羔羊2只，剖检取心血、肺脏、肝脏等。

主要试剂和仪器TaqDNA聚合酶和dNTP，购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；支原体肉汤培养基和支原体琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯。PCR仪和凝胶成像分析仪为BIO．RAD。

1．2 方法

1．2．1 细菌分离纯化 病料无菌操作接种于绵羊鲜血平板、巧克力平板和改良LB肉汤［3］，37℃培养24～36h，三线四区分离纯化，镜检。在鲜血平板上生长的菌落形态一致，染色结果相同的暂归为同一种菌；在同一个平板上同一病料初次接种生长的同一种菌，菌苔和菌落数量明显较多的归为优势菌株。

1．2．2 支原体分离培养 无菌操作将病料匀浆，1倍稀释，离心后过0．45μm的滤器，滤液接种于支原体肉汤培养基和支原体琼脂培养基上10%CO237℃培养72h，观察肉汤变色和菌落形态。

1．2．3 PCR鉴定分析 分离纯化病原菌碱裂解法提取细菌基因组，参考细菌16SRNA通用引物F27：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R1492：TACGGYTACCTTGTTACGACTT扩增片段［4］，测序比对确定病原菌种属。扩增体系：10×Buffer 2．5 μL，dNTP（2．5mmol／L）2μL，F27（10μmol／L）1μL，R1492（10μmol／L）1μL，模板 DNA1μL，Taq酶0．3μL，加水补足25μL ；反应程序：94℃4min；94℃30s，56℃45s，72℃1．5min，30个循环；72℃延伸7min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶在1×TBE电泳液中电泳30min，EB染色，凝胶成像系统中记录结果。条带明亮清晰样的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。所得序列结果提交GenBank，BLAST对序列进行同源性比对鉴定，用MEGA 5．0软件进行聚类分析。

1．2．4 致病性试验 分离纯化优势病原菌LB肉汤培养24h，每5只小鼠1组腹腔注射0．2mL，对照组5只注射LB肉汤，观察小鼠死亡情况。

1．2．5 药敏试验 将各病料无菌碾磨，均匀涂布于绵羊鲜血平板上，再分别贴上药敏纸片37℃培养24 h。观察对常用25种常用兽药（阿奇霉素、头孢噻肟钠、氨苄西林钠、达力新（头孢呋辛钠）、头孢哌酮钠、头孢拉定、混感金刚（阿奇＋氟苯尼考）、超能链杀（硫酸庆大小诺霉素）、胜痢（硫酸粘菌素）、速喘宁（泰乐菌素＋磺胺）、宇生连枝监剑（泰乐菌素）、奇效痢停（庆大＋利福平）、林克霉素、混干百益（林可霉素）、痢拉克（环丙沙星）、卡那霉素、长效菌毒精品（普鲁卡因青霉素）、恶痢绝（氧氟沙星）、混感全能（氟苯尼考）、恩诺沙星、链磺速治（复合磺胺）、链霉素、青霉素G、重泻速克（痢菌净）和克林霉素）的敏感性（药敏纸片药品含量与判定标准参考杭州天和微生物试剂有限公司）。

2 结果

2．1 分离培养 从肺脏、肝脏分离到大量病原菌。革兰阳性球菌，溶血；革兰阴性小杆菌，不溶血。第1只羔羊病料培养情况，根据菌落大小、形态和溶血情况分离得到3株病原菌：XJ104－YF－1、XJ104－YF－2和XJ104－YF－3；第2只分离得到4株：XJ104－YF－4、XJ104－YF－5、XJ104－YF－6和 XJ104－YF－7。支原体培养结果阴性。

2．2 鉴定 PCR结果在预计1 500bp处扩增出单一明亮的目的片段（图 1）。序列比对（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／），结果7株菌为3种菌（图2）。两只羔羊肺炎病原都分离到化脓隐秘杆菌（Arcanobacteriumpyogenes）和链球菌（Streptococcus），另1只还分离到不动杆菌（Acinetobacter），各菌株16SrDNA序列提交GenBank登录号见表1。化脓隐秘杆菌和不动杆菌与NCBI上已登录的序列同源性达到100%，链球菌达到99%，均属于同一种菌［6］。

图1 16SrDNA PCR扩增

图2 羔羊肺炎病原菌16SrDNA序列聚类分析

表1 病原菌种属和登录号

2．3 致病性 化脓隐秘杆菌和链球菌具有较强的致病性，能在24h内使5只小鼠全部死亡，剖检死亡小鼠，从心血和肝脏中均能分离培养出初攻毒菌株；不动杆菌致病性不强，小鼠精神委靡后，恢复正常。对照组小鼠健活。

2．4 药敏 为了及时指导临床用药，控制病情。本试验直接将病料涂布于鲜血平板上做药敏试验。结果初次分离到病原菌仅对阿奇霉素、庆大霉素、氧氟沙星、头孢哌酮钠、头孢拉定、混感金刚、奇效痢停、氧氟沙星和氟苯尼考等有敏感性，其余大多中敏，很少有耐药。

3 讨论

16SrRNA序列分析是细菌系统分类研究中最常用的工具之一，其结构和功能高度保守。一般认为，16SrRNA序列同源性小于97%，可以认为属于不同的种，同源性小于93%～95%，可以认为属于不同的菌［6］。

本试验通过分离培养和PCR测序以及致病性试验，了解了此次羔羊肺炎发病的病原菌为化脓隐秘杆菌和链球菌，并非是多杀性巴氏杆菌。分离得到不动杆菌有可能是羔羊在发病后期，抵抗力差，环境中细菌通过呼吸道感染肺脏。绵羊传染性胸膜肺炎病原－支原体未能分离到，表明该羊场未受到支原体感染的威胁，否则病情会更加严重。

此次发病地点属高山牧场，以放牧为主。相对规模化养殖，抗生素的使用较少。因此药敏试验结果显示敏感药物较多，也为临床治疗提供了理论依据。

哈萨克羊是新疆当地土种羊，具有很强的抗寒和抗病能力。化脓隐秘杆菌和链球菌都是机会致病菌。化脓隐秘杆菌和链球菌混合感染羔羊先前未见报道，这次能够引起哈萨克羔羊发病，说明两种菌混合感染具有很强的致病性。杜昕波报道也从斑羚和岩羊肺炎中分离到化脓隐秘杆菌［6］。通过本试验的完成，为更有效治疗和预防羔羊肺炎，以及疫苗的研发提供依据。

［1］ 康立超，田亮，张晓宇，等．新疆牦牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药物敏感实验［J］．石河子大学学报（自然科学版），2010，28（4）：436－440．

［2］ 康立超，钟发刚，王平福，等．牦牛巴氏杆菌和葡萄球菌的分离鉴定［J］．中国兽医杂志，2008，44（10）：70－71．

［3］ 李建强，李六金．兽医微生物学实验实习指导［M］．西安：陕西科学技术出版社，1999：156－181．

［4］ Lane D J．16S／23SrRNA sequencing，In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics［M］．Edited by E Stackebrandt＆ M GoodfellowNewYork：Wiley，1991：115－175．

［5］ Stackebrandt E，Goebel B M．Taxonomic note：aplace for DNA－RNA reassociation and 16SrRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology［J］．Int J Syst Bacteriol，1994，44：842－849．

［6］ 杜昕波，赵耘．3株斑羚、岩羊化脓隐秘杆菌的鉴定及系统发育分析［J］．中国畜牧兽医，2010，37（4）：60－62．