青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测

王光华，叶成玉，蔡其刚，王戈平，陆 艳，张芳芳，马利青，周继章

（1．青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁810016；2．中国农业科学院兰州兽医研究所

家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃 兰州730046）

牛病毒性腹泻病毒（BVDV），也称牛病毒性腹泻－黏膜病病毒，与猪瘟病毒（CSFV）、羊边界病毒（BDV）同属黄病毒科，瘟病毒属成员，是有囊膜的单股正链RNA病毒，整个基因组大小约为12．5kb，包含有一个大的开放阅读框和两侧的非编码区［1］。开放阅读框编码一个近4 000个氨基酸的多聚蛋白（E2的克隆与序列分析），从N端到C端的顺序为：Npro（P20）、EC（P14）、E0（gP48）、E1（gP25）、E2（gP53）、P7、NS2－3（P125）、NS4A（P10）、NS4B（P32）、NS5A（P58）、NS5B（P75），其中EC、E0、E1和E2为结构蛋白，其他的为非结构蛋白［2］。其编码的结构蛋白主要位于BVDV基因组5′－N端部分。其中E0、E1和E2是糖基化蛋白。而E0、E2为保护性抗原基因，其蛋白具有抗原性，免疫原性以E2最强，但E2是BVDV结构蛋白中变异率较高的一种蛋白，抗原逃逸及突变频率较高，是导致疫苗保护失效和牛持续性感染的主要原因［3］。E0是BVDV编码蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，产生的中和抗体具有中和BVDV和HCV的能力［4］，因此它可用于研究基因工程亚单位疫苗及基因工程诊断抗原，防治牛病毒性腹泻。本试验中克隆和表达了BVDV青海牦牛QHZK株的E0基因，为进一步研究BVDV E0蛋白的生物学活性，制备基因工程诊断抗原奠定了基础。

1 材料与方法

1．1 试剂 限制性内切酶EcoRI、XhoI、IPTG、ExTaq酶、pMD18－T载体、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；低分子量蛋白质 Marker，DL－2 000DNA Marker，T4DNA连接酶，氨苄青霉素，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；BVDV标准阳性血清，购自中国兽医药品监察所；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG，购自Sigma公司。

1．2 质粒与菌种 pMD18－T－E0质粒，由本实验室构建并保存；DH5α菌株，购自宝生物工程（大连）有限公司，Rosetta菌株，购自北京全式金生物技术有限公司，原核表达载体pET－32a由本实验室保存。

1．3 E0基因的原核表达及抗原性检测

1．3．1 E0基因的扩增 引物序列为：PF1 5′－CCCGAATTCATGGAGAACATAACACA－3′，PF2 5′－CCCCTCGAGTTATGCATATGCCCC－3′。反应条件及体系：按照RT－PCR试剂盒说明书操作，反应体系（25 μL）：10×RT－PCR Buffer 2．5μL，dNTP mixture（2．5 mmol／L）4．0μL，RNase inhibitor（40U／μL）1．0μL，上下游引物（0．1μmol／L）各1μL，AMV reverse transcriptase（5U／μL）0．5μL，Taqpolymerase（5U／μL）0．5μL，总 RNA （1μg／μL）2．0μL，DEPC水12．5 μL。PCR反应条件：45℃30min；95℃3min；94℃30 s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min。反应结束后取5μL PCR产物以5V／CM恒定电压于10 g／L琼脂糖凝胶中电泳。

1．3．2 E0基因的纯化及克隆 用胶回收试剂盒纯化BVDV QHZK株E0基因PCR产物，将纯化后的产物与pMD18－T载体连接。连接产物转化至DH5α菌株，经氨苄青霉素、X－gal筛选，挑取白色菌落接种于5mL含氨苄青霉素（终浓度50μg／mL）的LB培养基中，37℃振荡培养12h之后提取质粒。

1．3．3 重组质粒 pET－32α－E0的构建 将pET－32a原核表达载体和pMD18－T－E0克隆质粒分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，用胶回收试剂盒回收具有黏性末端的E0基因和pET－32α原核表达载体，在T4DNA连接酶作用下16℃连接5h，连接产物转化至DH5α感受态细胞。

1．3．4 重组质粒的鉴定 将5μL连接产物转化到感受态细胞Rosetta（DE3）中，经IPTG／X－gal琼脂平板蓝白菌落筛选，随机挑选白色菌落用含氨苄抗性的LB培养基培养，提取质粒后进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定。将鉴定正确的质粒命名为pET－32α－E0。

1．3．5 重组质粒的诱导表达、蛋白纯化与抗原性检测 取50μL阳性克隆菌液加入到5mL含50μg／mL氨苄青霉素（50μg／mL）的LB液体培养基中，37℃，220r／min振荡培养过夜。次日按1∶50增菌于含氨苄青霉素（50μg／mL）的LB培养基中，培养至吸光度OD600为0．6～1．0之间，取出1mL未诱导菌液做阴性对照，4℃保存。余者加入IPTG至终浓度1mmol／L，200r／min，37℃诱导表达4h收集菌液，取1mL于1．5mL的离心管中，6 000r／min离心3min，弃上清，收集菌体。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）检测表达产物。

2 结果

2．1 E0基因的原核表达

2．1．1 E0基因的 RT－PCR扩增 将 RT－PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在700bp左右处有一特异性扩增条带，与预期产物大小相符，如图1。

图1 E0基因RT－PCR扩增产物的鉴定

2．1．2 重组质粒pET－32α－E0的鉴定 重组质粒pET－32α－E0经PCR以及EcoR Ⅰ、XhoⅠ双酶切得到约700bp目的基因片段，与预期的结果一致（如图2），证明重组质粒构建成功。

图2 重组质粒pET－32α－E0的PCR和酶切鉴定

2．1．3 E0基因表达产物的检测 重组质粒pET－32α－E0转化入Rosetta感受态细胞中，经IPTG诱导4h，将不同时间段收集的诱导菌液变性处理后进行SDS－PAGE分析（图3）。在约44kDa分子量标记处，出现明显的电泳条带，与预期结果相符，表明目的蛋白获得表达。

图3 E0基因表达产物的SDS－PAGE分析

4 讨论

牦牛作为青藏高原上的稀有牛种，主要生长在我国2 500m至5 000m的高山草原上。自1983年［5］，李佑民等在我国首次分离并鉴定出BVDV以来，该病在我国牛群中流行较广，造成了极大的危害，但国内学者对于牦牛BVDV分子生物学方面的报道较少，因此，开展牦牛BVDV的分子生物学研究意义重大。本研究对青海牦牛BVDV毒株的E0蛋白进行了生物信息学分析，采用生物学软件对E0蛋白的抗原指数、亲水性及B细胞抗原表位进行了分析。结果表明，E0蛋白氨基酸的亲水性与抗原性指数呈平行相关性，QHZK株E0蛋白氨基酸的亲水性与抗原性指数与标准毒株VEDEVAC、C24V非常相似，从而证明E0基因在BVDV各毒株间具有一定保守性，有利于研究亚单位疫苗。

本试验用原核表达载体表达BVDV E0基因时发现，E0基因所含的密码子有10%左右是E．coli不常用的稀有密码子。有资料表明，当目的基因中存在过多E．coli不常使用的密码子时，其在E．coli中的表达量一般很低［6］，所以本试验在表达E0基因时采用了Rosetta（DE3）菌株，该菌株因可以提供密码子tRNAs，从而可以显著提高带有较多稀有密码子的E0基因在E．coli中的表达量，试验结果也证明E0蛋白得到了较高的表达量。

E0是BVDV编码蛋白中保守性较E2更高的蛋白，该蛋白上的中和表位产生的中和抗体具有中和BVDV和HCV的能力，氨基酸序列分析结果也表明，在此蛋白内有一高度保守的结构域，因此E0蛋白更适合做亚单位基因工程疫苗，E0蛋白氨基酸生物信息学分析也证明了这一点。本研究中所表达的E0蛋白在Western－blot试验中能与标准毒株制备的抗BVDV阳性血清发生免疫反应，证明了表达的BVDV QHZK株E0蛋白具有良好的抗原性。

［1］ 陆承平．兽医微生物学［M］．3版．北京：中国农业出版社，2001．

［2］ Rumenapf T，Unger G，Strauss J H，etal．Processing of the envelope glycoproteins of peativiruses［J］．Journal of Virology，1993，67（6）：3288－3294．

［3］ Hertig C，Stalder H，Peterhans E．Genetic Heterogeneity within the coding region of E2and NS2in strain of bovine viral diarrhea virus［J］．Gene，1995，153（2）：191－195．

［4］ 项勋，段纲．牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）的分子生物学研究进展［J］．家畜生态，2004，25（4）：202－204．

［5］ 李佑民，刘振润．牛病毒性腹泻／粘膜病病毒株（长春184株）的分离与鉴定［J］．兽医大学学报，1983，3（3）：113－120．

［6］ Chen T，Inouye M．Suppression of the negative effect of minor argine codons on gene expression，preferential usage of minor codons with in the first 25codons of the Eschiscoli genes［J］．Nucleic Acids Research，1990，18：1465－1473．