青海藏系绵羊BMP2基因的克隆及其序列分析

宋 静，杨发龙，陈 刚，王 杰，钟金诚，郑玉才

（1．重庆长寿区疫病预防控制中心，重庆 长寿 401220；2．青海大学农牧学院，青海 西宁 810003；3．西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

“西宁毛”，又称西宁大白毛，是青藏高原土著品种藏系绵羊所产白色羊毛。具有纤维粗、长、富有光泽、弹力强、拉力大、净毛率高（约70%左右）等特点，是目前世界上粗毛类型中的优质毛［1］。科学开发利用青海藏羊这一宝贵遗传资源，对青藏高原畜牧业的发展具有十分重要的意义。

骨形态发生蛋白（BMP）是 Urist（1965）［2］年对脱钙骨基质的成骨研究中发现的，存在于骨基质中，可以诱导间充骨细胞分化为软骨及骨细胞。BMP家族决定家畜不同时期的生长发育、骨骼形成，并且该家族部分成员，特别是BMP2基因，是毛囊发育所涉及的信号分子之一。BMP家族的成员在毛囊形态发生的过程中主要起抑制性作用。BMP－2／4作为毛囊发育阶段的抑制物的信号途径之一，Noggin作为BMP的抑制因子，在毛囊形态发生中对BMP的效应起负性调节，BMP－2和BMP－4被Noggin抑制活性的平衡状态将刺激毛囊发育的开始［3］。作为影响羊毛品质的侯选基因，研究其在序列上与其他品种的差异，旨在为进一步寻找控制藏系绵羊羊毛性状及品质的主效基因提供一定的分子生物学基础。

1 材料与方法

1．1 样本及处理 藏系绵羊，由青海省三角城种羊场提供。采样部位选在试验羊体侧部肩胛后缘约一掌处。局部剪毛、剃毛、清洗、碘酊涂布消毒、酒精脱碘，剪取约2cm×2cm大小皮肤，迅速在室温生理盐水中冲洗3次后置于高压灭菌过的玻璃小瓶中，封口，装入冰瓶后送至实验室，－80℃保存。

1．2 主要试剂和仪器E．coliTop10 、pMD18－T Vector（T 载 体）、RNAiso Reagent、ExTaq酶、dNTPs，均购自日本TaKaRa生物工程有限公司；3SSpin Agarose Gel DNAPurification kit胶回收试剂盒，购自上海申能博彩科技有限公司；T4DNA连接酶，购自北京天为时代科技有限公司；DEPC、Marker（1 000bp和2 000bp）等，均购自Sigama公司。

主要仪器有凝胶成像系统（VerSa Doc，美国Bio－Rad公司）、PCR 仪（TGRADIEN T9700，德国Eppendorf公司）。

1．3 方法

1．3．1 皮肤中总RNA的提取和检测 根据Sigama公司提供的总RNA的提取方法进行皮肤总RNA的提取。取冻存的皮肤组织约100mg左右，加入Trizol试剂1mL，匀浆后加0．2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0．5mL预冷异丙醇，离心沉淀后弃上清，800mL／LDEPC乙醇洗沉淀，用DNase酶解可能残余的基因组DNA。提取的RNA用DEPC处理的灭菌三蒸水溶解，－80℃保存。

1．3．2 引物设计及合成 参考GenBank中绵羊（Ovis aries）BMP2及大鼠18SRNA基因mRNA的序列，利用Primer 5．0软件分别设计BMP2特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其序列分别如下：F1：5′－TGGTTTCGTGGTGGAGGT－3′；R1：5′－CATGATTCGTGGAGTTCAG－3′。

1．3．3 RT－PCR扩增目的基因 以藏系绵羊皮肤中提取的总RNA为模板，Oligo2dT为引物，用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver．3．0试剂盒成cDNA第1条链，获得样品RNA的cDNA（s），以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为：95℃5 min；95℃30s、52℃30s、72℃30s，共40个循环；72℃10min，4℃保存。

1．3．4 重组标准品质粒的制备 PCR产物经10 g／L的琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，试剂盒回收，与pMD18－T载体连接，转化到TOP10感受态细胞中，筛选白色菌落并划线培养，质粒提取，PCR、酶切和测序鉴定。

2 结果

2．1 组织总RNA的提取和目的基因片段的扩增

提取的总RNA经紫外分光光度计检测，其OD260／OD280＝1．69，说明提取的 RNA 有较好的纯度。经RT－PCR扩增，获得350bp左右的片段，序列测定表明，获得的目的条带同原始序列的同源性为100%。

2．2 重组质粒的PCR鉴定 将RT－PCR获得的目的片段连接到pMD18－T载体进行克隆。挑取单个白色菌落分别培养于2mL LB液体培养基中培养过夜，并提取质粒作为模板进行PCR扩增，电泳后得到356bp左右的片段，与预期结果一致，结果如图1。说明目的片段成功插入到pMD18－T载体中，所得重组子为含有BMP2基因cDNA插入片段的重组阳性克隆质粒。

图1 藏系绵羊KAP6．1基因RT－PCR结果

2．3 测序结果 克隆基因测序结果仅获得藏系绵羊BMP2基因356bp的部分CDS区，编码118个氨基酸。用DNAMAN 4．0对藏系绵羊BMP2基因编码区进一步分析可知，其碱基组成为A（24．72%）、C（26．40%）、T（20．79%）、G（28．09%）。其中嘧啶碱基（C＋T）占47．19%，嘌呤碱基（A＋G）占52．81%，GC含量为54．49%。

2．4 藏系绵羊BMP2基因cDNA编码区核苷酸序列和氨基酸序列与其他物种的比较 将藏系绵羊BMP2基因编码区核苷酸序列与GenBank中普通绵羊（AF508028．1）、山 羊 （EU854586．1）、牛 （NM－0010－99141．1）、大鼠（NM－007553．2）、猪（EU854587．1）、马（AY008772．1）、兔（NM－001082650．1）和人（NM－001200．2）8个物种BMP2基因mRNA序列进行比较，并计算序列间同源性大小（表1，图2）。结果表明，青海藏系绵羊与绵羊亲缘关系最近，同源性为100%；其次是山羊，有1处核苷酸差异，同源性99．44%；再次是牛和猪，有7处和28处核苷酸差异，同源性分别为98．03%、91．80%；马、大鼠和人与青海藏系绵羊分别都有43处核苷酸差异，但同源性分别为87．89%、87．61%、和87．17%、；而兔与青海藏系绵羊有46处核苷酸差异，同源性为87．04%。

由核苷酸序列推导的氨基酸序列比较可知，藏系绵羊BMP2基因编码的氨基酸序列与普通绵羊、山羊和牛的同源性均为100%；与猪、马、大鼠、人和兔的同源性为96．61%、95．76%、94．92%、94．62%和94．07%。

图2 藏系绵羊BMP2核苷酸序列和由其推导的氨基酸序列下划线为引物序列

表1 7个物种KAP6．1编码区核苷酸序列同源性及距离阵距

图3 7个物种KAP6．1编码区核苷酸序列同源树

2．5 物种间分子系统进化树分析 利用DNAMAN4．0、BioEdit4．8、Mega4．0等生物软件对藏系绵羊、普通绵羊、山羊、牛、兔、鼠和人的核苷酸序列分别构建分子间系统发育树（图3，图4）。结果表明，两种方法构建的物种间分子系统进化树结果基本一致，藏系绵羊与普通绵羊先聚在一起，再与山羊聚为一类，而后与牛和兔聚在一起，最后与鼠和人聚为一类。

图4 7个物种KAP6．1编码区核苷酸序列分子系统发育树

3 讨论

本试验通过RT－PCR技术首次从青海藏系绵羊皮肤中克隆得到了长为356bp的藏系绵羊BMP2基因cDNA序列，包含一个不完整的编码区。初步分析表明，通过多物种BMP2基因片段的序列比对分析，生物进化树的绘制，青海藏系绵羊BMP2基因部分cDNA核苷酸序列与其他哺乳动物同源性很高。与普通绵羊、山羊、牛、马、猪、大鼠、兔和人的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别高达87．04%和94．07%以上。初步分析，青海藏系绵羊和普通绵羊核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均为100%。山羊与青海藏系绵羊和普通绵羊在进行编码区核苷酸序列比对时，只有一处差异，即编码第一位氨基酸－甘氨酸的第3位密码子由T变为G，但由其编码的氨基酸并没有发生改变，所以山羊与青海藏系绵羊和普通绵羊核苷酸序列同源性为99．44%，但其氨基酸序列同源性为100%。藏系绵羊与普通绵羊、山羊、牛、兔、鼠及人之间分子系统进化树的构建，结果表明，BMP2基因在不同物种之间具有较高的保守性，BMP2基因编码区适用于进行不同物种间起源进化和种系发生关系的研究。

BMP2是骨形态发生蛋白成员之一，属于TGF－β1超家族成员，具有分泌型蛋白的特征，其生物活性很高，不仅具有促进软骨和骨组织形成的作用，而且证实对骨组织，脑组织和脊髓组织的生长、发育、分化有重要的调节作用，并参与细胞凋亡和细胞信号转导的调节，同时BMP2作为毛囊诱导的抑制物对于动物的毛囊形成和发育具有一定的调控作用。BMPs其他方面的生物学活性也是跨种属的，这都与BMPs的结构在种属间高度保守相一致［4］。序列分析显示出明显进化上的保守性和高度序列同一性，这种同源性在一定程度上代表着物种亲缘关系的远近，同时也反映了其对生物体的功能重要性。这对BMP2基因功能和调控的研究有重要的意义，也为下一步青海藏系绵羊BMP2全长基因的克隆、表达以及基因功能的研究奠定了基础。

［1］ 木也．西宁毛［J］．中国土特产，1997（2）：35．

［2］ Urist M R．Bone：formation by autoinduction［J］．Science，1965，150（698）：893－899．

［3］ Botehkarev V A，Botehkareva N V，Roth W，1999a，Noggin is a mesenehymally－derived stimulator of hair follicle induction［J］．Nature Cell Biol，1999a，1：158－164．

［4］ 潘贵超，温建民，潘贵春．骨形态发生蛋白－2的研究进展［J］．中国中医骨伤科杂志，2006，14（6）：78－90．