婴幼儿辅食中细菌总数及蜡样芽孢杆菌污染情况分析

杨文龙，陈雅蘅，王继金，刘 勇，周帼萍*

（武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023）

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，简称Bc）是一种广泛存在于空气、土壤中的条件致病菌，也是最常见的食源性致病菌之一，4℃～50℃皆能生长，能引起呕吐型和腹泻型2种不同类型的食物中毒。呕吐型食物中毒是高度稳定的呕吐毒素（Cereulide）引起中毒，严重时能致死，多为储存不当的碳水化合物食品引起。腹泻型食物中毒与多种肠毒素（如溶血素Hbl、非溶血性的肠毒素Nhe和细胞毒素CytK等）有关，中毒症状相对温和，多为储存不当的蛋白质食品引起。中毒主要症状是恶心、呕吐、腹痛、腹泻、头晕等，中毒的食物中检出Bc数量一般在105CFU/g～108CFU/g。Bc能在多种食物中检测出，如剩米饭、米粉、面粉等淀粉食物，甜点、肉类制品等富含脂类及蛋白质的食品[1]。

从国内外Bc食物中毒死亡案例来看，国外案例几乎都与未成年人相关，国内大多数案例也涉及到未成年人[2]。在1995年我国湖南省有一个案例报道有多名儿童在食用某多维米粉及全脂营养奶粉后出现呕吐、发热、腹泻等症状，其中4名儿童因高热抽搐死亡[3]，这是我国蜡样芽孢杆菌食物中毒案例中最严重的案例之一。说明婴幼儿因免疫力低下，对该类细菌中毒更敏感。

Bc的鉴定目前有很大争议。蜡样芽孢杆菌群细菌（B.cereus）原来包括了蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、蕈状芽孢杆菌（B.mycoides）和假蕈状芽孢杆菌（B.pseudomycoides）、韦氏芽孢杆菌（B.weihenstephanensis）6个种，2010-2013年又增加了3个新种：B.cytotoxicus[4]、B.manliponensis[5]和B.gaemokensis[6]。由于该群内各种间在基因组上的高度一致，必须采用非常复杂的生理生化反应结合分子生物学技术才能鉴定，加上一些新种的定义还存在很大争议，要准确鉴定蜡样芽孢杆菌几乎成为不可能完成的任务；现行的国家标准GB/T 4789.14—2003《食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》和食品及药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）标准都未与最新分类系统接轨，同时很多研究者也质疑标准中所采用生理生化法的繁琐和准确性[7]；同时因为Bc有很多毒素基因，除呕吐毒素合成相关基因外，都位于基因组内，并广泛分布在Bc群各种菌株中，所以很多学者在探讨食品安全问题时也将Bc群细菌一起讨论[8-9]。本研究鉴定的Bc，严格意义上仅鉴定到Bc群，排除了苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌和假蕈状芽孢杆菌，但是未区分其他6个种。

本研究从细菌总数和食源性致病菌——蜡样芽孢杆菌2个指标分析婴幼儿辅食的微生物污染情况，以期提高婴幼儿食品的质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 检测样品

市售婴幼儿辅食，覆盖高中低档产品及国内外32个品牌，样品均购自超市保质期内合格产品，共101份（米粉60份；奶伴侣30份；面条11份）。

1.1.2 培养基

胰酪胨大豆多粘菌素肉汤（trypticsoypolymyxinbroth，TSPB）培养基：胰酪胨17.0g，植物胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水稀释至1000mL，pH7.3±0.1；甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（mannitol yolk polymyxin agar，MYP）培养基：a.牛肉膏1.0g，蛋白胨10g，D-甘露醇10.0g，氯化钠10.0g，琼脂15g，酚红0.025g（配成溶液加入），蒸馏水稀释至900mL，pH 7.2±0.1，b.50%卵黄液，c.多粘菌素B 100IU/mL，将a液121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后加入b液和10mL c液；Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，琼脂20g，蒸馏水稀释至1000mL；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15g，蒸馏水稀释至1000mL，pH7.2±0.2。

1.2 仪器与设备

GNP-9080隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；YS100正置荧光相差显微镜：日本Nikon公司；TC-312 PCR仪：英国TECHNE公司；680X SYNGENE凝胶图像分析系统：英国Syngene公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落总数测定

根据食品安全国家标准GB 4789.12—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》[10]。

1.3.2 蜡样芽孢杆菌的检测

按照进出口商品检验行业标准SN 0176—1992《出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法》[11]，采用最大近似值（most probable number，MPN）法检测。

1.3.3 ITS PCR检测

PCR扩增体系：2×TaqPCR Mix 25μL；上下游引物各1μL；DNA模板5μL；加水至50μL。16S～23SrDNA间隔区引物：ITS-16S-1392-S-15（GNACACACCGCCCGT）；ITS-23S-206-A-21（NCTTAGATGTTTCAGTTCVCY），扩增条件：95℃、1min；95℃、45s；55℃、1min；72℃、1min30s；循环30次；后延伸72℃、5min[12-13]。

1.3.4 形态观察

染色后用显微镜观察有无伴孢晶体排除苏云金芽孢杆菌；在PCA和LB平板上是否根状生长，排除蕈状和假蕈状芽孢杆菌。再确定蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表计算蜡样芽孢杆菌的MPN值。

1.3.5 统计分析

采用SPSS20.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 蜡样芽孢杆菌的鉴定

图1 部分Bacillus cereus16S/23S rDNA ITS PCR结果Fig.1 Partial result of PCR analysis of 16S/23S rDNA ITS of Bacillus cereus

由图1可知，炭疽芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌等芽孢杆菌群细菌在进行16S～23S rDNA转录间隔区的PCR分析时呈现一致的特征条带，可以与近缘其他芽孢杆菌区分，成为该群细菌分型和鉴定有力的工具[12-13]。选取在MYP培养基中呈现典型蜡样芽孢杆菌群细菌菌落特征的菌株进行ITS序列分析。第二道的枯草芽孢杆菌出现了3条亮带（约为500bp、700bp和900bp），而其他菌株包括Bc标准株均会出现2条亮带（500bp和750bp），验证了文献方法，说明ITS序列分析在鉴别Bc群微生物有效性。通过ITS PCR分析可以将分离株鉴定到Bc群细菌。

图2 Bacillus cereus镜检结果Fig.2 Microscopic examination result ofBacillus cereus

镜检观察分离株菌体为杆状，成短或长链。产芽胞，芽胞圆形或柱形，中生或近中生，孢囊与菌体等宽，未发现伴孢晶体，排除苏云金芽孢杆菌，图2为Bc典型株的显微形态。PCA平板上37℃，培养24h可形成灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，较大菌落，未发现有根状生长的特征，排除蕈状和假蕈状芽孢杆菌。

2.2 婴幼儿辅食中菌落总数及蜡样芽孢杆菌检测

GB10769—2010《食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品》中菌落总数的规定[14]，菌落总数不得超过104CFU/g（mL）。依据此标准，101份样品中仅30个样品的菌落总数达标，达标率仅为29.7%，菌落总数的几何平均数为1.9×104CFU/g。蜡样芽孢杆菌的阳性检出率为96.9%（95/98），阳性样品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范围内，19个样品的Bc菌数大于1100CFU/g，几何均数为350.7CFU/g。

2.3 不同品牌婴幼儿辅食中细菌总数和蜡样芽孢杆菌检测

对32个品牌产品中细菌总数和蜡样芽孢杆菌含菌量进行比较，有18个地方性小品牌因生产品种单一，采样数量有限，将其合并列入地方品牌进行对比。

图3 不同品牌婴幼儿辅食中细菌总数检出结果Fig.3 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different brand

图4 不同品牌婴幼儿辅食中蜡样芽孢杆菌的检出结果Fig.4 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different brands

经分析各个品牌婴幼儿辅食中的细菌总数和蜡样芽孢杆菌检出情况有显著性差异（p＜0.05），如伊利、方广和雅士利等品牌的细菌总数和蜡样芽孢杆菌含菌量都较低；而酷幼、百氏利臣和小阿哥等品牌产品的细菌总数和蜡样芽孢杆菌含菌量都偏高。各品牌之间的差异反应了不同的生产商采取的灭菌工艺的不同和过程监控水平的差异。但也须指出，即使是同一品牌的不同批次样品，其检出情况也有较大波动，说明每个品牌在生产不同批次的产品时可能因为原辅料、设备和温湿度等环境因素造成微生物污染水平的波动。从这次检测分析数据来看，Bc并非婴幼儿辅食中的优势菌，其数量占细菌总数的0～7%。

2.4 不同类别婴幼儿辅食中细菌总数及蜡样芽孢杆菌检测

图5 不同类别婴幼儿辅食中细菌总数的检出结果Fig.5 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different classes

图6 不同类别婴幼儿辅食中蜡样芽孢杆菌的检出结果Fig.6 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different classes

由图5和图6可知，比较配方米粉、奶伴侣和面条3类产品中细菌总数和蜡样芽孢杆菌数的检出结果，发现在3种水分活度很低的干粉（或干条快）状食品中这2项指标均呈现出配方米粉＞奶伴侣＞面条的趋势。

2.5 不同添加配料婴幼儿辅食中Bc检测

市售婴儿配方米粉配料中维生素和矿物质大多类似，常添加的一些配料来改变口味，不同品牌间同一口味的配料有少许差异，但主要配料类似。根据配方中的配料进行分类比较，不同添加配料Bc检测情况见表1。

表1 不同配料婴幼儿辅食中蜡样芽孢杆菌检测结果Table 1 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food with different ingredients

由表1可知，无添加口味即原味婴幼儿辅食蜡样芽孢杆菌的含菌量为最低，其他有添加配料的样品Bc都比无添加的高。添加有双歧杆菌等益生菌的样品细菌总数最低可能是因为采用的是好氧菌细菌总数测定的方法，厌氧菌不长，检不出来；同时可能存在拮抗效应导致好氧菌数量下降；但是其复杂的发酵、调配工序增加了Bc污染几率导致Bc均数偏高，也反应出益生菌的发酵对蜡样芽孢杆菌没有明显的拮抗/抑制作用。一般认为Bc作为土壤中常见细菌容易污染植物性原料，这些植物配料的加入会导致染菌风险上升。但是研究发现添加肉蛋类配方也会导致Bc含菌量的升高，达到甚至高于添加蔬菜和谷物等植物性辅料产品。

2.6 不同货架期婴幼儿辅食中细菌总数及蜡样芽孢杆菌检测

图7 不同货架期婴幼儿辅食中细菌总数检出结果Fig.7 Examination results of total bacterial count in infant formula food of different shelf-life

图8 不同货架期婴幼儿辅食中蜡样芽孢杆菌的检出结果Fig.8 Examination results ofBacillus cereusin infant formula food of different shelf-life

所有产品的保质期在14～18个月，由图7、图8可知，在货架期在5个月之前，细菌总数基本稳定有缓慢增加趋势，蜡样芽孢杆菌数基本稳定；但到第5个月之后，细菌总数出现下降趋势，但是蜡样芽孢杆菌数却显著增加。这可能是由于包装好的婴儿辅食中水分活度较低，细菌总数稳定，长期甚至可能缓慢下降，可能由于无竞争微生物，食源性致病菌蜡样芽孢杆菌的数量却在货架期5个月后开始大幅度上升。说明如果在产品货架期内仅用细菌总数来衡量微生物的污染和增殖情况，并推测产品的安全，不仅片面而且有风险。以上几何均数有统计学意义（p＜0.05）。

3 讨论

婴幼儿免疫力低、食物品种单一，食物中毒风险高，所以婴幼儿食品的各项安全指标要高于普通成人食品。此次调查结果发现单就细菌总数而言：101份样品居然只有30份样品菌落总数达标，合格率仅为29.7%；而且部分超标产品的细菌总数居然达到105CFU/g～106CFU/g。另外，从食源型致病菌蜡样芽孢杆菌的检出情况也不容乐观：样品中Bc检出率达96.9%，平均含菌量为350.7CFU/g，19个（19.4%）样品的蜡样芽胞杆菌超过1100CFU/g。虽然我国对于婴幼儿食品中Bc的含量还没有制定相关标准，但就国际上来说，澳大利亚规定婴幼儿乳粉Bc含菌量＜103CFU/g；新西兰对婴儿食用乳粉要求高，Bc含菌量＜102CFU/g；挪威、爱尔兰、加拿大（婴幼儿食品）等限定食品中Bc含菌量＜104CFU/g。

Bc的污染可能来源于原料，还有生产环境和设备。婴儿辅食主要由大米和奶粉作为主要原料，而这两种恰恰是Bc污染比较严重的食品原料。在Bc食物中毒中有70%的案例都是由米饭引起[15]。本实验室调查我国市售大米中Bc的污染情况发现80%的大米受到Bc污染，原料奶中最常见的污染菌就是Bc群细菌，喷雾干燥不能完全灭活芽孢，奶粉在包装等后续工艺中也可能受到后污染，这些芽孢在贮藏、销售和消费的过程中，一旦条件合适就能生长繁殖产毒[16]。最为危险的是热稳定毒素Cereulide，一旦合成，后续的任何食品加工工序都无法使其失活[1]。

另一方面食品加工工序越是复杂，越容易受到微生物污染。配料越多、工艺越复杂，往往Bc含菌量越高。研究显示在Bc可以吸附到不锈钢材料等设备表面，在生产过程中污染产品[17]。特别是Bc能产芽胞、具有耐热性，一般食品加工的热处理和消毒杀菌条件不一定能完全杀灭芽胞。如果企业重视卫生管理和质量监控，加强工艺的优化，保证设备定期清洁，加工过程中将被污染可以大大降低。

作为条件致病菌的蜡样芽孢杆菌是否会导致严重食物中毒取决于3个因素：含菌量；菌株致病力；食用前的加工和保存条件，所以即使是达标产品保存不当也存在一定风险。欧洲食品安全局就特别指出：婴儿配方食品如检出致病性的Bc，经温水调和后如果存放不当可能导致其繁殖并产毒。冲调类婴儿食品应一次食完，未食用完的已冲调好的婴儿配方米粉不可放入冰箱冷藏再食用，防止呕吐毒素Cereulide在室温和冷藏时合成，如再次食用，即使原含菌量很低的产品也可能因细菌增殖和产毒使抵抗力低的婴幼儿中毒[17]。

4 结论

市售婴儿辅食中细菌总数和蜡样芽孢杆菌污染检测分析结果表明，101份样品中只有30份样品菌落总数达标，合格率仅为29.7%，部分超标产品的细菌总数达105CFU/g～106CFU/g；其中食源型致病菌蜡样芽孢杆菌的检出率为96.9%，阳性样品含菌量在3CFU/g～1100CFU/g范围内，平均含菌量为350.7CFU/g，19个样品的蜡样芽孢杆菌超过1100CFU/g。

我国对于婴幼儿食品中Bc的含量应尽快制定相关标准，提升婴幼儿配方食品的质量安全水平，保障婴幼儿食用安全、放心的食品，这关系下一代健康成长，关系亿万家庭的幸福和国家民族的未来。

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