中药复方制剂中盐酸小蘗碱、黄芩苷和芦丁含量的高效液相色谱测定方法建立

汪 洋，檀华蓉，周冠宇，王希春，吴金节＊

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036；2.安徽农业大学生物技术中心，安徽合肥230036）

中药复方透皮贴剂（专利号：ZL 2010 1 0132973.2）为治疗奶牛乳房炎的纯中药制剂，含有黄连、马兰、木芙蓉、黄芩、紫花地丁等成分，具有清热解毒、行气活血散瘀等功效［1］。黄连的主要成分为盐酸小蘗碱［2］，黄芩的主要成分为黄芩苷［3］，木芙蓉中含有芦丁［4］，马兰、紫花地丁均含有黄酮类成分［5－6］。为了确定该复方中有效成分的含量，本试验建立了测定其中3种不同主要有效成分盐酸小蘗碱、黄芩苷、芦丁的高效液相色谱（high efficiency liquid chromatography，HPLC）方法，为制定该中药制剂的质量标准提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器设备 Waters高效液相色谱仪（600泵，2998紫外检测器）为美国Waters公司产品；Sartorius 1712电子分析天平为德国Sartorius公司产品；KQ－400KDE 超声波清洗器为昆山市超声仪器有限公司产品；RE－5203旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器有限公司产品；索氏提取器。

1.1.2 试剂 黄连、马兰、木芙蓉、黄芩、紫花地丁等均购于亳州济人药业有限公司；盐酸小蘗碱和黄芩苷对照品购于中国药品检验所（批号分别为A0151－20mg，A0016－20mg）；芦丁购于中国药品生物制品鉴定所（批号100080－200707）；乙腈、冰醋酸为色谱纯（TEDIA）；水为娃哈哈纯净水。

1.2 方法

1.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱：PhenomenexC18（4.6mm×150mm，5μm）。流动相：乙腈（B）－10mL／L冰醋酸（C）。洗脱方式：梯度洗脱（0→25min，B 20%→40%，C 80%→60%；25min→30min，B 40%→20%，C 60%→80%）。流速：1.0mL／min。检测波长：265nm。柱温：30℃。

1.2.2 溶液制备

1.2.2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸小蘗碱、芦丁对照品各10mg以及黄芩苷5mg，置于10mL量瓶中，用800mL／L甲醇溶解定容至刻度，即得3种对照品储备液。

1.2.2.2 供试品溶液制备 精密称取复方中所有中药材（粉碎后）1.8g置于平底烧瓶，用药材6倍量的600mL／L乙醇回流提取3次，每次3h。醇提液经3 000r／min离心后取上清液保存为药液Ⅰ。药渣再用水煎煮提取，提取2次，每次8倍量水，每次1h。水煎液经离心除杂后得药液Ⅱ。合并药液Ⅰ和药液Ⅱ旋转蒸发至干，加入800mL／L甲醇定容至25mL。

1.2.3 线性关系考察 分别吸取上述3种对照品储备液，用800mL／L甲醇稀释成100μg／mL（盐酸小蘗碱、芦丁）和50μg／mL（黄芩苷）的混合溶液。再将此混合溶液等比稀释成6个不同浓度，分别进样10μL，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析。

1.2.4 精密度试验 取同一份混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μL。分别计算盐酸小蘗碱、芦丁和黄芩苷含量的RSD值。

1.2.5 重现性试验 取同一批药材，分别照1.2.2.2供试品溶液制备方法提取得6份供试品溶液，照拟定的样品含量测定方法操作测得峰面积，分别计算盐酸小蘗碱、芦丁和黄芩苷的RSD值。

1.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于提取后0、2、4、6、8、10h进样。照拟定的样品含量测定方法操作测得峰面积，分别计算盐酸小蘗碱、芦丁和黄芩苷的RSD值。

1.2.7 回收率试验 精密称取已知含量的复方中药9份，分别精密加入高、中、低3个不同浓度的标准品3份，按1.2.2.2供试品溶液制备方法操作。照拟定的样品含量测定方法操作测得峰面积，计算盐酸小蘗碱、芦丁和黄芩苷的平均加样回收率。

1.2.8 样品测定 精密称取3份同一批次中药材，按供试品溶液方法提取后以既定含量测定方法操作，进样10μL。对色谱图进行分析，计算样品中盐酸小蘗碱、黄芩苷和芦丁的含量。

2 结果

2.1 对照品溶液色谱图

在1.2.1条件下色谱图见图1。盐酸小蘗碱、黄芩苷和芦丁分别在8、15、18min时出峰，分离效果良好。

图1 盐酸小蘗碱、黄芩苷、芦丁高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride，baicalin and rutin

2.2 线性关系考察结果

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析后得到回归方程。盐酸小蘗碱：Y＝17 455X＋2 959.2，R2＝1；黄芩苷：Y＝78 251X－34 125，R2＝0.9 999；芦丁：Y＝12 912X＋7 513.9，R2＝0.999 8。

2.3 精密度试验结果

经计算得到盐酸小蘗碱RSD值为1.07%，黄芩苷峰面积RSD值为1.41%，芦丁峰面积RSD值为1.10%。可见精密度良好。

2.4 重现性试验结果

经计算得到盐酸小蘗碱RSD值为0.90%，黄芩苷RSD值为1.56%，芦丁RSD值为1.61%。可见供试品溶液提取方法重现性好。

2.5 稳定性试验结果

经计算盐酸小蘗碱RSD值为0.60%，黄芩苷峰面积RSD值为0.76%，芦丁峰面积RSD值为0.89%。供试品溶液在室温10h内稳定。

2.6 回收率试验结果

根据测定结果计算平均加样回收率，其中盐酸小蘗碱为98.5%（n＝9，平均RSD＝1.70%）；黄芩苷为98.1%（n＝9，平均 RSD＝1.10%）；芦丁为101.1%（n＝9，平均 RSD＝1.87%）。本方法回收率高，分离效果好。结果见表1、表2和表3。

2.7 样品测定结果

以既定含量测定方法测定供试品溶液中盐酸小蘗碱、黄芩苷、芦丁含量，色谱图见图2，测定结果见表4。盐酸小蘗碱、黄芩苷和芦丁的平均含量为0.368 1、2.155 6、1.167 1mg／g。结果表明该检测方法稳定可行。

表1 盐酸小蘗碱加样回收试验结果Table 1 Recovery test result of berberine hydrochloride

表2 黄芩苷加样回收试验结果Table 2 Recovery test result of baicalin

表3 芦丁加样回收试验结果Table 3 Recovery test result of rutin

图2 试验样品高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of the test samples

表4 试验样品含量测定结果Table 4 The contents determination results of the samples mg／g

3 讨论

根据待测成分的相关文献报道和紫外扫描图谱分析，芦丁的最大紫外吸收值主要在255nm和356 nm附近［7］，盐酸小蘗碱的最大紫外吸收值主要在254nm和353nm附近［8］，黄芩苷主要在280nm和316nm附近［9］。因此，本试验主要考察了265nm、350nm两个波长的检测效果，为达到三者兼顾的目的，最终采用了265nm作为检测波长。在此波长下各成分均有较好的检测效果。

试验首先在《中华人民共和国药典》2005年版（一部）中芦丁的高效液相色谱含量测定方法［10］基础上，通过改进后采用流动相甲醇40mL／L∶冰醋酸（62∶38），等度洗脱为色谱分离条件。在此条件下，标准品分离良好（分离度＞1.5），但供试品溶液却无法得到有效分离。通过参考相关文献［11］和不断摸索，最终通过更换流动相为乙腈（B）－10mL／L冰醋酸水溶液（C），梯度洗脱（0→25min，B 20%→40%，C 80%→60%；25min→30min，B 40%→20%，C 60%→80%）等一系列方式，使得标准品和供试品溶液均得到了有效分离。

李文霞等［11］建立了三黄片中黄芩苷和盐酸小檗碱的检测方法，陈良等［12］建立了测定不同产地罗勒中芦丁和槲皮素含量的方法。本试验的中药复方透皮贴剂为一种新型专利药物，对已有的多个药物成分的检测方法不完全适用。因此，为了确定该复方中有效成分的含量，本试验建立了同时测定其中3种不同主要有效成分盐酸小蘗碱、黄芩苷、芦丁含量的HPLC方法。本方法快速、准确且专属性强，对新药质量标准的的建立和生产中的质量控制具有一定的意义。

［1］ 冯士彬，李志明，孟庆娟，等.中药复方透皮贴剂对奶牛临床型乳房炎的疗效及其机理［J］.江苏农业学报，2011，27（4）：790－794.

［2］ Xu Han，Lianhong Yin，Lina Xu，et al.Simultaneous determination of ten active components in Chinese medicine“Huang－Lian－Shang－Qing”tablets by high－performance liquid chromatography coupled with photodiode array detection［J］.Anal Lett，2010，43：545－556.

［3］ 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2010）［M］.北京：中国农业出版社，2010：413－414.

［4］ 孟会宁，罗国平.HPLC法测定木芙蓉叶中芦丁的含量［J］.安徽医药，2007，11（8）：705－706.

［5］ 郑和权，周守标，朱肖锋，等.马兰总黄酮提取工艺优化及不同部位含量测定［J］.食品与发酵工业，2008，34（11）：185－189.

［6］ 付戈妍，付 克，王洪光，等.超声波提取紫花地丁总黄酮及含量测定［J］.内蒙古民族大学学报：自然科学版，2008，23（5）：512－513.

［7］ ŠatínskýD，JägerováK，HavlíkováL，et al.A new and fast HPLC method for determination of rutin，troxerutin，diosmin and hesperidin in food supplements using fused－core column technology［OL］.Food Anal Meth，2012，12：14.

［8］ Kim J M，Ah J H，Choi J S，et al.Comparative analysis of the anti－inflammatory activity of Huang－lian extracts in lipopolysaccharide－stimulated RAW264.7murine macrophage－like cells using oligonucleotide microarrays［J］.Arch Pharma Res，2010，33（8）：1149－1157.

［9］ Islam M N，Downey F，Carl K Y Ng.Comparative analysis of bioactive phytochemicals fromScutellaria baicalensis，Scutellaria lateriflora，Scutellaria racemosa，Scutellaria tomentosa and Scutellaria wrightii by LC－DAD－MS［J］.Metabolomics，2011，7：446－453.

［10］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：426.

［11］ 李文霞，宋平顺.HPLC法同时测定三黄片中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量［J］.药学进展，2011，35（4）：178－181.

［12］ 陈 良，徐晓琴，凯撒·苏来曼.HPLC测定不同产地罗勒中芦丁和槲皮素的含量［J］.中国现代应用药学，2011，28（4）：344－346.