补中益气丸对糖尿病大鼠胃黏膜MUC1和iNOS表达的影响

张永斌，刘晓秋，陈 嘉，伍军军，李守军

（1.广州中医药大学实验动物中心，广东广州510405；2.广州中医药大学脾胃研究所，广东广州510405；3.华南农业大学兽医学院，广东广州510642）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是最常见的慢性病之一，各型糖尿病的发病率逐年上升［1］。目前各种糖尿病并发症的防治已成为糖尿病研究的重要课题，糖尿病的发生和发展与脾胃、胃肠损伤关系密切，糖尿病胃肠损伤常影响口服降糖药物和其他药物的疗效，以及食物的代谢吸收，进而影响糖尿病的进程［2］。胃肠黏膜在胃肠腔和胃肠上皮之间起着半渗透屏障作用，胃肠黏蛋白（mucin，MUC）是胃肠黏膜的主要结构单元，由胃肠上皮细胞（包括黏液颈细胞、杯状细胞等）分泌，MUC1是胃肠黏膜MUC家族的主要成员，是上皮细胞表面跨膜糖蛋白，一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）存在结构性NOS（cNOS）和诱导型 NOS（iNOS）。在糖尿病状态下胃肠黏膜MUC、NOS均发生显著变化，在胃肠黏膜的损伤和修复中MUC、NOS之间存在间接和直接的相互作用，如 Phillipson M 等［3－4］发现，MUC的缺陷与NOS的缺陷有依从关系，iNOS缺陷常伴随MUC缺陷，致使黏膜层变薄，黏膜层MUC的累积降低。为进一步探讨糖尿病状态下MUC1和iNOS在胃组织的表达水平及补中益气丸的作用，利用链脲佐菌素（streptozocin，STZ）腹腔注射结合乙醇灌胃建立了糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型，通过免疫组化的方法，动态观察了胃组织中MUC1和iNOS的表达，为中医脾胃理论、中药复方作用机理的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠100只，雄性，体重180g～220g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2008－0020。

1.1.2 试剂 补中益气丸颗粒为九芝堂股份有限公司产品；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）为美国Sigma公司产品；兔抗鼠MUC1多克隆抗体和兔抗鼠iNOS多克隆抗体均为北京博奥森生物技术有限公司产品；DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 稳豪血糖仪为强生中国医疗器材有限公司产品；Olympus系统生物显微镜为日本奥林巴斯株式会社产品；TS－8型转移脱色摇床为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；CU－420型电热恒温水浴箱为上海一恒科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 大鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射STZ（用0.1mol／L，pH 4.2的柠檬酸钠－柠檬酸缓冲溶液配制成10g／L的溶液），剂量55 mg／kg，在STZ注射72h后监测随机血糖，连续3次血糖值≥16.8mmol／L，且有多饮、多尿，多食症状，入选糖尿病动物模型，糖尿病造模同时灌胃300mL／L乙醇，剂量10mL／kg，连续4周。

1.2.2 动物分组及处理 大鼠随机分为正常组24只，DM造模组76只，造模4周后，各组各处死6只动物取胃称重并作胃黏膜检查，将造模组中入选糖尿病动物模型并伴胃肠道症状的大鼠随机分为模型组18只，糖尿病＋补中益气丸组18只（简称中药组，下同）。各组动物从试验第5周起开始给药并每月监测随机血糖一次，正常组及模型组等体积生理盐水（20mL／kg）灌胃，连12周，中药组给予补中益气汤灌胃，3.75g／kg，连12周。

1.2.3 标本提取及处理 试验第8周、12周和16周末，正常组、模型组和中药组各选6只动物（空腹12h）称重后颈椎脱臼处死，开腹迅速取出胃并称重，计算胃重量指数（胃重量指数＝胃重量／体重×100%），剪取胃组织作40mL／L多聚甲醛固定。

1.2.4 病理观察 胃组织100mL／L甲醛固定后石蜡包埋，制备4μm切片进行HE染色，观察胃黏膜损伤及修复变化。

1.2.5 免疫组化染色方法 4μm石蜡切片脱蜡水化，抗原修复，阻断过氧化物酶活性，分别滴加MUC1（1∶75）、iNOS（1∶75）4℃孵育过夜，再滴加二抗IgG于37℃孵育20min，DAB显色，苏木素复染2min，胞浆棕黄色颗粒沉着的为阳性细胞，读片时每张片子取上下左右中5个黏膜区域拍照，应用Image－Pro Plus 6.0病理图象分析软件测定各组胃黏膜免疫阳性产物的吸光值（OD值），每张切片随机测定5个视野，同时测定同一张切片上胃组织的OD值作为背景，免疫反应产物的OD值减去背景OD值得到校正的OD值（COD值），即为各阳性产物的实际吸光度值，然后求平均值作为该样本的COD值。

1.2.6 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以¯x±SD表示，多样本均数比较采用单因素方差LSD检验。

2 结果

2.1 各组大鼠临床观察

注射STZ后，造模大鼠约有72%的动物出现血糖持续升高并陆续发生死亡，糖尿病大鼠毛色枯黄无光泽，毛态竖立，精神倦怠，体型消瘦，饮水排尿增多，懒动等症状，模型组大鼠在试验期间的血糖值与正常组比较均显著升高（P＜0.01），提示糖尿病实验模型成功（表1），中药组经补中益气丸治疗后，大鼠症状有所改善，但血糖值与模型组比较无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血糖比较Table 1 Comparison of blood glucose in rats of three groups mmol／L

2.2 试验各组大鼠胃重量指数变化

造模4周后，模型组和治疗组大鼠均出现胃肠功能紊乱，剖检发现胃黏膜有点状、条索状糜烂和出血灶，随病程加长，模型组和中药组胃壁变薄，变轻，模型组胃重量指数逐渐下降，在试验12周时与正常组比较差异显著（P＜0.05），16周时差异极显著（P＜0.01），并见有溃疡，中药组重量指数下降较模型组缓慢，在16周时与正常组比较差异显著（P＜0.05）（表2）。从血糖水平、胃黏膜肉眼观察结果显示，已初步建立了较稳定的糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型（表2）。

2.3 病理观察结果

正常组大鼠胃黏膜上皮细胞连续性好，腺体排列整齐，黏膜层次结构清楚，黏膜肌层和黏膜下层未见毛细血管扩张淤血。模型组大鼠胃黏膜层上皮细胞黏液变薄、缺失、细胞间隙变大、有轻度的坏死，胞浆有空泡变性形成，毛细血管可见有扩张，炎细胞浸润。中药组大鼠胃黏膜病变稍轻，未见明显坏死。

表2 各组大鼠胃重量指数比较Table 2 Comparison of stomach weight index in rats of three groups

2.4 各组动物胃组织iNOS阳性表达结果

模型组MUC1阳性表达随病程进展而降低，第8、12周的MUC1阳性表达与正常组比较，差异显著，第16周时差异极显著（P＜0.01，图1）。中药组MUC1阳性表达高于模型组，但两组间比较无统计学意义（P＞0.05），中药组在12周时有所上升，与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 各组大鼠胃组织MUC1表达的比较Table 3 Comparison of MUC1of gastric tissue in rats of three groups

图1 各组大鼠MUC1的表达情况（400×）Fig.1 Expression of MUC1in gastric tissue in rats of three groups（400×）

2.5 各组动物胃组织iNOS阳性表达结果

模型组阳性表达在第4周时明显降低（表4），与正常组比较差异显著（P＜0.05），第8周后明显升高，第8、16周的阳性表达与正常组比较差异显著（P＜0.05，图2）。中药组在第8周、12周和16周的iNOS阳性表达有所上升高，但与正常组比较无显著差异（P＞0.05）。

表4 各组大鼠胃组织iNOS表达的比较Table 4 Comparison of iNOS of gastric tissue in rats of three groups

图2 各组大鼠iNOS的表达情况（400×）Fig.2 Expression of iNOS in gastric tissue in rats of three groups（400×）

3 讨论

建立糖尿病动物模型常采用大鼠腹腔注射STZ损毁胰岛β细胞的方法建立［5－6］，本试验采用腹腔注射STZ结合300mL／L乙醇灌胃方法制作糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型，造模后大鼠普遍出现毛色枯黄、精神倦怠、体型消瘦、饮水排尿增多、懒动、便溏等症状，剖检见胃黏膜充血和点状出血，随病程延长，胃壁变薄。糖尿病大鼠的临床症状及胃黏膜组织学检查结果显示，本试验已成功制作出糖尿病大鼠胃黏膜损伤模型。

MUC与其他蛋白质相互作用共同完成体内组织的屏障、修复及愈合等作用［7］，有大量保护性蛋白在黏膜表面的黏附层，这些蛋白质与MUC一同分泌，通过蛋白结构域和糖基化位点，与MUC相互作用，或从黏膜凝胶提供的粘弹性水溶液环境中获益，影响它们的防御作用。iNOS活性更易受到多水平的调节，包括转录、翻译、翻译后修饰、蛋白质－蛋白质相互作用［8］，在极化的上皮细胞和在离子转运体附近的肠腔膜，iNOS与支架蛋白EBP50相互作用，将激活或抑制细胞因子诱导的iNOS。在糖尿病状态，大鼠胃黏膜的 MUC1、iNOS均发生显著变化，模型组MUC1随病程进展逐渐降低，模型组大鼠iNOS活性在STZ注射4周后显著降低，胃体黏膜显示大量的出血性损伤，随病程进展，胃黏膜iNOS活性显著增强，持续催化产生大量NO，致使黏膜变薄，黏膜层 MUC累积降低，与 Lee D L等［9－10］报道基本一致。上述结果表明iNOS在糖尿病胃黏膜损伤方面起着重要作用，MUC、NOS之间可能存在间接和直接的相互作用，有待进一步验证。

中医药防治糖尿病（消渴病）的历史悠久，经验丰富。“脾”与“胰”的关系密切，脾虚是糖尿病的重要病机。补中益气汤是益气健脾的代表方，古有“医王汤”之称，临床上应用补中益气汤加味治疗胃溃疡、糖尿病性胃轻瘫、糖尿病性腹泻等病证，均取得了较好的疗效。如王雪、周黎等［11－12］用于治疗糖尿病性胃轻瘫，陈青、汪何等［13－14］用于治疗糖尿病性腹泻均取得较好疗效。许家骝等［15］发现，补中益气汤的精制颗粒、汤剂、丸剂均对无水乙醇、消炎痛等所致大鼠急性胃黏膜损伤及幽门结扎性胃溃疡模型有明显保护作用，三者均能明显升高腺胃部组织前列腺素（prostaglandins，PGs）含量。在本试验中，补中益气丸能调节MUC1和iNOS的相互作用及表达，阻止胃黏膜损伤和糖尿病的进一步发展。中药复方作为一种天然的复杂体系，为调节蛋白质－蛋白质相互作用提供了可能性，在调节蛋白质－蛋白质相互作用方面有待进一步深入研究。

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